专题文献速递 | DNA结构用于纳米孔技术

背景

DNA纳米技术已经被广泛地应用于人工通道或孔的组装，大多数研究都是基于纳米孔的外部结构来进行纳米孔的设计，从纳米孔内部来进行功能的增强尚未得到进行广泛的研究，2024年6月发表在JACS上的文章“Passing Behavior of Oligonucleotides through a Stacked DNA Nanochannel with Featured Path Design”通过构建具有独特内部形状的DNA纳米通道，设计了一种堆叠的DNA折纸纳米通道。

作者通过模块化的组装策略来构建和设计了一种可用于寡核苷酸检测的DNA折纸纳米通道，整个DNA nanochannel （DNC）设计为以堆叠方式形成，由两个模块组成，分别是用于膜穿透的基本模块（B-DNC）和一个用于通道长度延长的附加模块（A-DNC）组成，B-DNC 由三层构建而成：内层核通道（浅橙色）、层间通道室（橙色）和外层壳（深橙色）， A-DNC 由 24 个平行 DNA 螺旋以 5 × 5 方形晶格方式组装，留下一个宽约 2.5 nm 的清晰中心通（图1），整体特征表现为宽度可变的通路，由狭窄的入口和出口通道以及宽的、可改变的管腔。作者记录了DNA 寡核苷酸（21 和 58 nt）的运输过程，显著停留时间表明寡核苷酸由于宽度变化，存在滞留的分子通过过程，同时，使用特异性捕获剂，还可以为适配的子链产生独特类型的信号，展现了DNA 折纸通道的灵活性和可编程性强调了在定制通道属性（如长度、宽度和内部修饰）方面的独特优势。

图1 DNA 折纸纳米通道的结构设计和表征（原文Figure1）

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c02734

膜纳米孔是生物学DNA 测序中分子运输的关键，传统上，运输依赖于几纳米宽的桶状通道，而对于更宽更大的可调形结构，利用蛋白质来构建具备相当大的挑战性，而研究表明DNA设计可以有效极大地扩展膜纳米孔的结构和功能范围，2022年发表于Nature Nanotechnology上的文章“Highly shape- and size-tunable membrane nanopores made with DNA”则进行了开创性的膜纳米孔的设计。

传统DNA纳米孔的设计中，所有双链体都以垂直于膜的方式定向，这样限制了DNA结构的自由度，而在这篇文章中。作者为了扩展DNA纳米孔的大小和形状，让成束的DNA 双链体形成平行于膜模块化排列的亚基，而模块化子单元的使用，极大地拓展了设计范围，一系列多边形的设计（图2）以及可控亚基的边长使设计的通道管腔从43 nm²可以扩展到400nm²,与传统的蛋白质孔面积相比，扩大了260倍。

图2 形状和大小可调的基于 DNA 的膜纳米孔（原文Figure1）

在自然界中已知的纳米孔中，离子通道是研究最多、功能最复杂的孔，具有两个重要特性：高选择性过滤和机械门控传输.响应环境刺激，离子通道可以动态改变其几纳米的内宽，以允许或阻止货物通过。现有的两个挑战是管腔可调孔，具有更宽的管腔，用于可控的跨膜大分子传输，以及结构稳定的孔，用于分子传感中的低噪声可重复电读数。发表于Nature Communications上的文章“A lumen-tunable triangular DNA nanopore for molecular sensing and cross-membrane transport”则探索了一种能够同时解决这两个问题的DNA纳米孔的合成。

借用上一篇的思路，作者设计了一个结构稳定的相当大小的三角形 DNA 纳米孔，三角 DNA 纳米孔由三个亚基组成，这些亚基通过单链铰链相互连接，其中并排成束的长 DNA 双链体作为核心层，成束的短 DNA 双链体作为内层和外层，两个相邻的单层末端通过单股铰链互连形成 V 形夹。由特异性 DNA 结合触发，特异性 DNA 结合用于捏合和释放三角框的三个角，从而机械激活 DNA 纳米孔，从 DNA 纳米孔扩张状态 （DNP-E） 切换到 DNA 纳米孔收缩状态 （DNP-C）在所设计的纳米孔的机械转变过程中，管腔在收缩和膨胀状态下都保持三角形构型。

图3 三角 DNA 纳米孔的转化机制和结构特征（原文Figure1）

除此之外，利用肺溶血素 （PLY）也可以有效地形成稳定的超宽孔、2022年12月发表在JACS上的文章“Functionalized DNA-Origami-Protein Nanopores Generate Large Transmembrane Channels with Programmable Size-Selectivity”介绍了一种利用PLY与DNA折纸杂交形成复合物，从而构建纳米孔的方法。

将高电荷、亲水性 DNA 通道嵌入脂质双层的疏水核心中，DNA 通道外部显示的两亲性膜锚（例如胆固醇、卟啉、烷基链）提供了高能量输入。能量需求随着通道宽度的增加而呈二次方增长，需要在 DNA 通道上进行大量两亲性标记，为了减少膜的锚点，降低疏水性介导的通道聚集，作者将PLY 的 N 末端半胱氨酸与 5'-氨基修饰的 DNA 寡核苷酸结合，再与环形DNA折纸杂交（图4），该复合物可自发地在富含胆固醇的膜上形成大孔（管腔>20nm），其实验结果表明 PLY 介导的杂化纳米孔形成的稳健性和有效性，除此之外，作者将DNA-折纸通道与一种模型nup蛋白Nsp1嫁接，验证了该纳米孔在分子尺寸选择性上的潜力。

图4 PLY-DNA 环的构建和膜插入活性(原文Figure1)

原文链接：1）https://doi.org/10.1038/s41565-022-01116-1

2）https://doi.org/10.1038/s41467-024-51630-0

3）https://doi.org/10.1021/jacs.2c11226

DNA 折纸技术通过将带有许多短 DNA 寡核苷酸（“订书钉”）的长单链 DNA （ssDNA） 支架折叠成设计师的 2D 和 3D 形状，实现纳米结构的精确自组装。基于 DNA 折纸的纳米孔，管腔直径为 5 至 35 nm，已在以前的许多工作中得到证明。通过 DNA 锁定/解锁链进行设门，打开/关闭“盖子”，或可逆地在通道内连接聚合物刷以阻止生物分子易位，但是到现在为止，大多数DNA纳米孔都是静态的，虽然能够控制通道的打开，但是不能实现通道直径的调控，为了更好地模拟生物离子通道，让纳米孔能够进行动态的“开放“和”闭合“状态，和实现多种刺激触发动态过程。2023年4月发表在Advanced Materials上的文章“ Multi-Stimuli-Responsive and Mechano-Actuated Biomimetic Membrane Nanopores Self-Assembled from DNA”，率先探索了一种具有受控纳米级机械转变的大直径膜纳米孔的合成。

相较于传统的几纳米的小管腔尺寸的纳米孔的合成，我们理想状态下成孔应实现刺激响应性以及孔形状和管腔的纳米机械驱动。同样的，纳米孔应当具备更宽且可调的管腔。内宽为 >5 nm 的孔具有普遍意义，因为它们可以容纳大分子蛋白质或蛋白质复合物，以便在单分子水平上进行直接传感。作者由此开发了经历由生物分子和物理刺激触发的构象转变的纳米孔，并提供高达 >10 nm 宽的管腔。

为了赋予孔隙响应生物分子刺激的可调结构刚度，设计了两条设计路线在第一种情况下，DNA 刺激控制 DNA 结合机械孔 DMP。孔的刚性是可调的，因为它的亚基与 ssDNA 环互连，这些 ssDNA 环与刺激 DNA 链杂交形成双链体，使孔稳定在开放状态。第二种设计是类似的，但使用蛋白质作为触发因素，其中蛋白质结合机械孔 （PMP） 在其角落携带蛋白质结合受体。特异性结合后，大体积靶蛋白（例如链霉亲和素）空间占据角落并迫使机械纳米孔采用开放构象。

图5 自组装 DNA 制成的机械纳米孔的设计和功能原理

2024年7月发表于Advanced Materials 上的文章“Compliant DNA Origami Nanoactuators as Size-Selective Nanopores”则在上一篇的基础上进行了拓展和更深的研究，探索了一种可完全重构的纳米孔的合成。

作者引入了一种灵活的机制来设计了一个完全可重构的跨膜DNA折纸纳米孔（简称MP），机械可驱动 MP 由一个菱形结构组成（图1），该结构由 4 个翻转的“L”形亚基组成，该亚基由 22 个螺旋束组成，设计成蜂窝状晶格，以最大限度地减少全局扭曲，这种设计可以通过添加触发链来来完全控制纳米孔的配置，从而实现主动打开和关闭机制，其中最终状态完全稳定。该MP 能够响应外部触发，在 3 种配置（封闭↔、中间↔、开放）之间进行可控切换，产生的纳米孔面积范围为 ∼100 nm²至 500 nm².，而且MP在插入囊泡过后也能实现同样的受控操作，使得该MP能够允许特定大小的分子进行跨膜运输。

图6 可重构 MechanoPore 的设计和工作原理（来自于原文Figure1）

原文链接：1）https://doi.org/10.1002/adma.202300589

2）https://doi.org/10.1002/adma.202405104