专题文献速递 | 碱基修饰核酸的应用

背景

在DNA中添加合成核苷酸不仅能增加DNA分子的线性信息密度，还能增加其三维折叠的多样性。发表在Nature Chemistry的这篇文章在23nt长的DNA链上的12个位点上放置额外的核苷酸（dZ，带有5-硝基-6-氨基吡啶酮核碱基），可以产生一个相当稳定的单分子结构（即折叠的Z-motif，或 fZ-motif），在66.5°C和pH 8.5下熔化（图1）。光谱、凝胶和二维 NMR 分析表明（图2），折叠的 Z 基序由六个反向细 dZ-:dZ 碱基对固定在一起，类似于自由杂环的晶体结构。为了获得关于fZ-motif结构的更多信息，作者合成了5′端有荧光标签（荧光素，FAM），3′端有淬灭剂（Dabcyl）的DNA分子。对于fZ-motif，在pH≈7.5和pH≈10之间没有荧光，这归因于fZ-motif的形成，它使FAM和淬灭剂非常接近（图2g）；然而，当pH值高于10时，荧光会恢复，这与dZ的完全去质子化、fZ-motif的展开是一致的。这也提供了第一条构象信息，无论在中等pH值下形成何种折叠，fZ-motif都必须使分子的5′端在pH≈7.5-9.5时接近3′端。

图1 fZ-motif结构

反向核苷酸对意味着平行链贡献了 dZ- 和 dZ 核苷酸对。荧光标记显示 dZ-:dZ 对在四链体紧凑的下-上-下-上折叠中连接平行链。它们有两种可能的结构，如图3所示：(a) 拓扑 1：类似于 pH ≤ 6.5 时 dC:dC+ 反向配对形成的 i-motif，具有一个下-上-下-上的结构，由 dZ-:dZ对夹杂稳定的平行链。(b) 拓扑 2：这是一种全新的折叠，其中下-上-下-上结构由dZ-：dZ对稳定的平行链组成，这些链不相互插入，而是彼此并排。因此，这种 fZ-位点可能有助于 DNA 形成结合和催化所需的紧凑结构。

这种纳米结构具有纳米机器、信号架构和医疗设备的实用价值。由于其pH驱动的可逆“开/关”活性，该分子可以在弱碱性条件下引发构象变化，而i-motif在弱酸性条件下被触发。虽然这些不是正常意义上的机器，但通过巧妙的设计将fZ-motif 和 i-motif结合起来可能在信号传导中有用，在未来的DNA逻辑电路设计领域也可能有用。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41557-024-01552-7

近期，发表在Nucleic Acids Research的这这篇文章报道了具有碱基、糖和骨架修饰的新AIMer设计的开发，提高了RNA编辑效率。AIMers 是短的、化学修饰的寡核苷酸，通过与作用于 RNA的内源性腺苷脱氨酶（ADAR）的相互作用，诱导 A 到 I RNA 编辑。ADAR酶将腺苷（A）转化为双链RNA中的肌苷（I），翻译机制将肌苷（I）读作鸟苷（G）。作者之前的工作表明，通过在AIMers中掺入磷酸胍（PN）骨架修饰，可以提高ADAR介导的RNA编辑的效率。ADAR活性也受到其靶A对面碱基的影响，该碱基被称为“孤儿碱基”位置。ADAR酶更喜欢编辑位点的A-C错配。这种偏好源于孤儿碱基与保守的谷氨酸残基之间的相互作用，该残基负责将靶A翻转到脱氨基的活性位点。谷氨酸可以与C形成氢键，但与G或A发生冲突。通过在编辑位点对面的“孤儿碱基”位置掺入N-3-尿苷（N3U）代替胞苷（C），进一步提高了效率。分子模拟表明，N3U可能通过稳定AIMer-ADAR相互作用来增强ADAR催化活性，并可能降低将靶碱基翻转到活性位点所需的能量（图2）。

图1

作者还探索了基于N3U的AIMers中孤儿位置的化学灵活性（图3）。在孤儿碱基位置使用 N3U 或其类似物可以增加化学灵活性，从而在孤儿位点及其周围加入更多的糖和碱基修饰。

总之，该研究描述了一种可扩展的合成方法来制造新型N3U及其类似物，包括使用标准固相合成掺入合成寡核苷酸的酰胺。当N3U作为AIMer的孤儿碱基时，它可以改善RNA编辑。在具有各种近邻序列的多个靶点上都观察到了 N3U 对 RNA 编辑的影响，这表明它至少可以部分克服 ADAR 酶的天然序列偏差。然而，N3U的益处大小不一，并受到AIMer和靶标的化学和序列背景的影响。总之，N3U 及其类似物的多功能性为 AIMer 的设计提供了有益的灵活性，拓宽了在保持药效的同时优化其他重要药理特性的途径。因此，N3U 在 RNA 编辑中的应用大大提高了这一新兴疗法的治疗潜力。

发表在Nucleic Acids Research的另一篇文章评估了用不同的非经典核碱基替换sgRNA中天然对应物的可行性和影响，包括^thG、2,6-二氨基嘌呤（DAP）、N¹甲基假尿嘧啶（m¹Ψ）和7-脱氮腺嘌呤（C7A）（图1），还研究了在靶 DNA 中引入 7-脱氮嘌呤的情况，以阐明 DNA 靶向机制，特别是 Cas9 内切酶对 PAM 区域的识别。该研究使用T7 RNAP变体用酶法合成了具有同构荧光噻吩鸟苷 (^thG)、BrC、7-脱氮腺嘌呤（C7A）和ClU的完全修饰的RZA（图1）。此外，d^thG可以通过Taq DNA聚合酶和其他三个碱基修饰的核苷酸一起掺入PCR产物中。

在体外CRISPR-Cas9切割试验中，获得的含有^thG以及^thG和BrC的RNA产物可以与天然sgRNAs一样有效地发挥作用（图2）。N1-甲基假尿苷（m¹Ψ）也被证明是尿苷的可靠非规范替代品，它是一种天然存在的尿苷异构体，当其掺入sgRNA时，可以指导Cas9核酸酶的切割。7-脱氮嘌呤对Cas9的失活表明，sgRNA和PAM位点嘌呤的N7原子对于实现有效的Cas9切割非常重要。

总之，该研究成功地合成了具有内在荧光的完全碱基修饰的^thG-dsDZA和^thG-RZA，这是首次使用酶法合成^thG-dsDZA和^thG-RZA。原则上，^thGTP 可作为一种有吸引力的鸟苷类似物，通过T7 RNAP 的酶法合成产生不同的功能 RNA，包括非编码 RNA、aptamers、核酶或 mRNA。经修饰的 RZA 因 ^thG 而具有强可见光发射，可在不改变 RNA 结构和功能的情况下对离散的生物分子事件进行荧光检测，因此可用于在细胞检测、RNA 催化和 RNA 结构分析中生成荧光探针。

原文链接：1）https://doi.org/10.1093/nar/gkae681

2）https://doi.org/10.1093/nar/gkac1147

发表在Science的这篇文章介绍了一种可口服的核苷类似物药物。最近被开发出来的奥贝德西韦（ODV，GS-5245）是一种RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂，是肠外给药瑞德西韦的口服替代品，并被证明对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）具有活性。奥贝德西韦（ODV，GS-5245）是瑞德西韦（RDV）母体核苷的口服前药，目前正处于治疗 COVID-19 的 3 期试验阶段。研究发现ODV及其循环的母体核苷代谢产物GS-441524对丝状病毒具有相似的体外抗病毒活性，包括马尔堡病毒、埃博拉病毒和苏丹病毒（SUDV）。从暴露于SUDV后24小时开始，对食蟹猴进行为期10天的每日一次口服ODV治疗，可以100%防止致命感染（图1）。转录组学数据显示，ODV治疗延迟了炎症的发作，并与抗原呈递和淋巴细胞活化有关。

图1 ODV 对 SUDV 的疗效

本研究结果为进一步开发ODV以更快地控制丝状病毒病的爆发提供了希望，而且与注射给药相比，口服抗病毒药物的供应、储存、分配，特别是给药的便利性，将有助于及时启动易于扩展的暴露后预防和早期疾病治疗。

发表在PNAS的这篇文章通过在北海道大学的化合物库中对753种核苷类似物进行了基于细胞的抗DENV2筛选，发现了2-硫尿苷（s2U）是一种广谱抗病毒核糖核苷类似物，对几种正向单链RNA（ssRNA+）病毒表现出抗病毒活性，如DENV、SARS-CoV-2及其变异毒株，包括目前正在传播的奥密克戎亚变体，但不抑制ssRNA-和DNA病毒的复制（图1）。研究发现s2U的分子靶点是ssRNA+病毒RNA 依赖性 RNA 聚合酶（RdRp）的活性位点，可抑制病毒 RNA 依赖性 RNA 聚合酶催化的 RNA 合成，从而减少病毒 RNA 复制（图2），这提高了动物模型中感染 DENV2 或 SARS-CoV-2 的小鼠的存活率。研究同时用不同剂量的四种核糖核苷（腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷）进行了抗病毒试验，以确认 s2U 是否作为核苷类似物发挥作用。在感染细胞中加入过量的外源性嘧啶核糖核苷（尿苷和胞苷）后，s2U 的抗病毒活性降低，而嘌呤核糖核苷（腺苷和鸟苷）的抗病毒活性则没有降低（图 2A），这表明 s2U 是通过作为嘧啶核糖核苷类似物来抑制病毒 RNA 复制的。为了表征s2U的分子作用机制，研究使用ZIKV NS5蛋白和s2UTP进行了体外引物延伸试验。尽管UTP被掺入RNA模板并延长了 RNA，但在下一个正确的核糖核苷酸存在的情况下，掺入s2UTP而不是UTP可能会阻断RNA的延伸（图2D和E）。这些结果表明，s2UTP作用于病毒RdRp并抑制病毒RNA合成。

图1 s2U 对黄病毒和 CHIKV 的广谱抗病毒活性

图2 s2U 的分子靶点和作用机制

总之，研究结果表明，s2U通过抑制病毒RdRp活性，对ssRNA+病毒表现出强大而安全的广谱抗病毒活性。病毒RdRp是开发广谱抑制剂的一个有前景的靶点，因为它在多种病毒中具有功能和结构上的保守性。因此，s2U（和s2U衍生物）的使用可以扩展到开发针对相关或新型病毒的新药，这些化合物可能有助于在流行病防备领域的进展。

发表在ACS Nano的这篇文章报道了一种酶原药疗法（EPT）治疗结直肠癌的方法（图1）。研究通过口服原药（5-氟胞嘧啶，5-FC）构建了真菌触发的原位化疗发生器（命名为 SC@CS@5-FC），用于治疗原位结直肠肿瘤。5-FC是一种抗真菌药物，对隐球菌和念珠菌具有强效抗菌活性。在胞嘧啶脱氨酶（CD）存在的情况下，5-FC可以转化为剧毒的5-FU，而由于哺乳动物细胞中没有CD，因此对哺乳动物无毒。作者通过将透明质酸钠（NaHA）和三聚磷酸钠（STP）与功能化壳聚糖（CS）交联，将5-FC载入壳聚糖纳米颗粒（CS@5-FC）中。CS@5-FC纳米颗粒通过静电相互作用附着在酿酒酵母（SC）表面，获得化疗药物发生器(SC@CS@5-FC）。口服后，SC@CS@5-FC通过SC趋向性表现出肿瘤靶向能力。此外，透明质酸酶（HAase）在肿瘤微环境（TME）中的过表达促进了透明质酸的降解，导致5-FC从CS@5-FC纳米颗粒中释放出来。无毒的5-FC在SC的胞嘧啶脱氨酶（CD）催化下转化为有毒的化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）。同时，SC和锌配位壳聚糖纳米颗粒可作为免疫佐剂激活抗原递呈细胞，进一步提高治疗效果。

图1 作用机制图

原文链接：

1）https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk6176

2）https://doi.org/10.1073/pnas.2304139120

3）https://doi.org/10.1021/acsnano.4c07115