专题文献速递 | DNA单分子力学探针近期的生物医学应用

背景

细胞通过表面受体与其环境连接，并利用受体配体键中的物理张力来进行各种细胞过程。单分子技术通过测量“断裂力”揭示了粘合强度，但人们很早就认识到断裂力取决于加载速率，即力增加的速度，这对生物力学检测的可靠性提出挑战。研究者开发了一种过度拉伸张力传感器overstretching tension sensor (OTS)，即使在机械活跃区域也能以单分子检测灵敏度进行更准确的力测量^[1]。

DNA在过度拉伸下 (>60pN) 时，会出现从传统的B-form到部分单链状态的转变，并由此引发杂交的解离，短链所需的解离力更小且和序列密切相关。研究者利用DNA过度拉伸诱导的寡核苷酸解杂交来测量16至95皮牛顿的单分子张力，发现解杂交力随着GC含量的增加而增加，并且解杂交力在不同的加载率下变化不大。

图 1 过度拉伸张力传感(OTS)的设计以及细胞力学的表征

研究者以此为依据设计了这种过度拉伸张力传感(OTS)，通过使用串联的OTSs，研究者能够测量单个整合素-配体键上的力加载率，发现上皮细胞的加载率约为0.99 pN/s，而白细胞的加载率约为2.7 pN/s。白细胞的整合素加载率大约是上皮细胞的三倍，这可能与白细胞在迁移过程中需要快速评估其机械环境有关。作者还研究了不同的细胞骨架抑制剂，如para-amino-blebbistatin、CK666和cytochalasin D，研究者发现这些抑制剂可以降低细胞的力传输事件和加载率，表明细胞骨架的动态性在力的产生和传递中起着关键作用。

这些实验结果为理解细胞如何通过单分子水平的机械转导来感知和响应其环境提供了新的见解，并为未来的生物物理和细胞生物学研究提供了重要的工具和方法。

为了弄清楚力量动态性，特别是力量加载率（LR），在受体信号和粘附形成中的重要意义。研究者开发了一种由工程化DNA结构组成的LR探针，该探针在两个不同的力阈值下经历两个机械转变：低力阈值（4.7 pN，发夹展开）和高力阈值（47 pN，双链剪切）^[2]。通过使用这种探针，研究者能够测量到整合素与其配体结合时的力量动态，特别是力量加载率（LR），其值在1.1 pN/s左右。

这一探针的设计借助了不同DNA结构对力的响应上存在的差异实现了两步的力响应，探针由两个特定的寡核苷酸链组成，一个锚链和一个配体链，锚链折叠成发夹结构，并带有供体染料（Cy3B）和FRET受体染料（Atto647N）。这一探针应用到细胞上可以实现原位的高通量力学信号的检测，并且通过FRET荧光的分析可以实现对复杂力学状态的快速检测。

图 2 两步 DNA 张力传感器的设计和应用机理

通过对八个细胞中成千上万个事件的自动分析，发现整合素与其配体结合并传递大于4.7 pN力量的键的寿命呈指数衰减，半衰期为45.6秒。这些事件的一个子集在大小上成熟到大于47 pN，具有1.1 pN/s的中位加载率，并且主要定位在细胞-基质连接的边缘。研究表明，只有一小部分最初与RGD配体结合并施加低水平力量的整合素会继续增加力量至47 pN。大多数整合素-配体复合体在经历超过5 pN的力量后会返回到低力量的非活跃状态。另外，观察到的力量加载率显示出高度的异质性，这可能对细胞的机械转导和粘附动力学有重要影响。

这一方法使得研究者能够在活细胞中以单分子分辨率测量整合素的力量动态，为理解细胞机械转导提供了新的视角。

细胞受体产生的分子力很少且短暂，往往需要高时空分辨率的仪器在单分子层级检测荧光，这增加了DNA分子力学探针的应用门槛。本文中报道了一种通过细胞力学现象激活CRISPR 相关蛋白 12a (Cas12a)的分子剪切反应，来延长并增强这一信号^[3]。从而实现了在宏观层级对细胞力学现象的快速检测。

研究者们开发的这种检测方法称为Mechano-Cas12a Assisted Tension Sensor (MCATS)，它通过将DNA双链固定在表面上，并在其一端修饰上细胞受体特异性配体，来实现对细胞牵引力的检测。当细胞在这些表面上施加力量时，如果力量足够大，会触发DNA双链的解离，从而暴露出Cas12a激活所需的序列，进而触发Cas12a对荧光报告链的催化切割，产生可检测的荧光信号。

图 3 基于cas12和DNA力学传感器的检测原理和检测流程

研究者以心脏搭桥手术（CPB）后患者的血小板功能为研究对象，测量了血小板在不同激活剂浓度下的牵引力，发现牵引力信号随着激活剂（如ADP）浓度的增加而增加。研究者们使用MCATS技术对一系列临床批准的抗血小板药物（如阿司匹林、eptifibatide、abciximab和ticagrelor）进行了活性筛选。使用MCATS技术，研究者们观察到不同抗血小板药物处理后的血小板牵引力信号呈现出剂量依赖性的减少，证实了这些药物对血小板功能的抑制作用。通过对单个健康捐赠者的血小板进行多次测量，研究者们发现MCATS信号的变异系数较低，显示出良好的重复性。

这些实验结果表明，MCATS技术是一种强大的工具，能够用于检测和量化细胞牵引力，评估抗血小板药物的疗效，以及在临床环境中快速评估患者的出血风险。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-023-01114-1

细胞的力学转导是一个重要的生物学过程，它涉及到细胞如何感知和响应外部力。了解细胞内力的传递动态对于理解细胞行为至关重要。研究者开发了一种新型的DNA探针，它通过两个具有不同力阈值和荧光标记的DNA发夹结构来测量力^[4]。这种设计允许对活细胞内的单个分子力进行直接测量。与传统的体外单分子力谱学方法相比，时空力学探针能够在动态的细胞环境中进行直接测量，克服了传统方法的局限性。

图 4 DNA时空力学探针，用于可视化活细胞中的单个整合素机械力动力学

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.05.008

T细胞受体（TCR）被认为是一种机械传感器，能够传递机械力给其抗原，并利用这种力来增强TCR信号的特异性和幅度。尽管已有多种分子探针被提出用于量化TCR的机械特性，但这些探针通常固定在硬质基质上，无法揭示细胞膜上TCR与抗原之间的流体相互作用。本研究开发了一种基于DNA折纸技术（DNA origami）的张力传感器（DOTS），这种传感器能够在动态的细胞膜连接处映射TCR的机械转导^[5]。DOTS的设计允许在微粒上高速筛选抗原，并通过流式细胞仪进行高通量检测。

相比起以往的力学检测器，要么依赖于一个硬质的基底用于检测，要么在柔性表面上的高密集分布会导致分子间的荧光干扰，这一检测器的设计借助了DNA折纸的结构可编程性实现了在柔软表面，如膜的表面进行固定，并且可以通过折纸结构调节分子检测器的排布密度避免分子间荧光干扰。

图 5 基于折纸的张力传感器的设计以及性能检测

利用DOTS，研究者量化了流体TCR-抗原键的机械力，并观察了这些力如何依赖于细胞状态、抗原流动性、抗原效力、抗原高度和F-肌动蛋白活性。通过改变DNA发夹的结构，研究者能够检测不同大小的力，并使用荧光寿命成像显微镜（FLIM）来测量力诱导的DNA发夹的展开。研究结果表明，TCR-抗原键在流体界面上经历超过8 pN的力，并且这些力受到多种因素的调节。研究还发现，TCR在细胞-细胞连接处传递的力具有特定的生物物理特性，且这种力信号对于激动剂抗原具有高度特异性。

这项研究不仅增进了我们对T细胞如何感知和响应抗原的机械特性的理解，而且提供了一种新的工具，可能有助于开发新的免疫疗法和疫苗策略。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-024-01723-0

文献参考