专题文献速递 | 无细胞系统在生物传感检测领域的应用

背景

无细胞系统通过将基因转录和翻译所需的酶集中于一个体外环境中，实现了基因回路在细胞外的功能性表达。这种系统的优势在于它可以被冻干，从而摆脱了对严格低温环境的依赖，使得由此制成的生物传感器更加便于携带和使用。受到pH试纸和侧流诊断技术的启发，研究人员将CFS反应巧妙地嵌入到多孔材料中，例如纸张，这使得在这种介质上能够轻松进行低体积（1-2 μL）的反应。这种基于纸张的无细胞系统不仅在实验室外稳定存在，而且以一种封闭且生物安全的形式，为现场快速检测提供了极大的便利。

来自巴西、加拿大、美国三国科学家组成的团队通过计算设计开发了一种基于toehold开关的传感器，专门针对Zika病毒的RNA基因组。他们成功研制了一种基于无细胞蛋白表达系统的纸基检测平台，并能够通过冷冻干燥技术在无需冷藏的条件下使用。当目标Zika病毒序列存在时，它会与Toehold开关的立足点区域特异性结合，引发Toehold开关的构象变化，从而暴露出核糖体结合位点。这一变化激活了β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的表达。该报告蛋白能够通过酶切氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）产生从黄色到紫色的光学信号变化，从而实现对Zika病毒序列的灵敏检测（如图1所示）。这一创新的纸基测试为现场快速诊断提供了一种高效、低成本的解决方案。

图1 基于纸张的诊断系统原理图

这种集成了分子生物学、硬件和软件工具的先进系统，在Zika病毒的检测中展现出了与逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）相媲美的诊断准确性，准确率高达98.5%。此外，研究团队还通过简单地更换分子组件，成功地将该系统应用于chikungunya病毒的检测，同样实现了98.5%的高准确率。本文所讨论的无细胞系统，在基于合成生物学的诊断测试中扮演了至关重要的角色。它通过支持RNA转录和蛋白质翻译、增强检测灵敏度、构建适应性系统，以及确保便携性和适用性，为Zika病毒及其他病原体的检测提供了一个高效且可靠的技术平台。这一创新成果不仅展示了无细胞系统在快速诊断领域的巨大潜力，也为未来应对新出现的病原体提供了新的策略。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-022-00850-0

基于CRISPR/Cas12或Cas13的反式剪切活性的诊断策略已经展现出了其在灵敏度、特异性、速度、效率和便捷性方面的显著优势。这种反式剪切活性，是指Cas12家族对任意单链DNA（ssDNA）或Cas13家族对任意单链RNA（ssRNA）的非特异性剪切。尽管这一特性为快速检测提供了强大的工具，但它也带来了挑战，尤其是在尝试在同一反应管中实现多重检测时。这种多重检测的实现需要精确的分子设计和优化，以确保每个目标序列都能被特异性地识别和剪切，同时避免非特异性的剪切反应干扰结果的准确性。尽管存在这些挑战，CRISPR/Cas系统的这一独特功能仍然为开发新一代的诊断工具提供了巨大的潜力。

在2023年3月，加拿大和美国的研究团队在《Nature Communications》杂志上发表了一篇题为“CRISPR-induced DNA reorganization for multiplexed nucleic acid detection”的研究文章。在这项开创性的研究中，作者介绍了一种创新策略，该策略将功能化的crRNA条形码序列与目标特异性的扩增输出相结合，并通过crRNA的转录和CRISPR系统的信号读出，实现了对核酸的多重检测。这一策略被命名为FACT（Functionalized Amplification CRISPR Tracing），它能够与Cas12a和Cas13a两种CRISPR系统兼容，无论是顺式剪切还是反式剪切，都能产生检测信号。

此外，研究者们还开发了一个可重编程的PAIRing系统（RePAIR），该系统将CRISPR/Cas12a的激活与蛋白质的表达相联系，从而实现了多种基于蛋白质的信号读取。这一综合策略被命名为FACT on RePAIR，简称FACTOR，它为CRISPR技术在核酸检测领域的应用提供了新的维度，展现了其在精准医疗和快速诊断中的潜力。

基于CRISPR体系的信号读取，作者们展示了三种策略：

第一种策略巧妙地利用了Cas12a的顺式剪切活性，将crRNA能够识别的activator设计成带有PAM位点的双链DNA分子信标探针（molecular beacon）。通过使用不同荧光基团标记的beacon探针，该方法能够实现一个灵敏且可多重检测的体系，为同时监测多种目标提供了一种高效的解决方案。

第二种策略则依托于Cas12a或Cas13a的反式剪切能力，在反应体系中人为添加与crRNA互补的dsDNA activator以及ssDNA报告探针（对于Cas12a）或ssRNA activator与ssRNA报告探针（对于Cas13a）。由于反式剪切作用的非特异性，这种方法在实现多重检测时面临一定的挑战，需要精确的设计和优化以确保特异性和灵敏度。

第三种策略则引入了无细胞蛋白表达系统（cell-free protein expression system，CFS），作者利用FACT作为一种调控因子，设计了一种基于CRISPR的可编程蛋白表达系统（RePAIR）。将FACT与RePAIR结合的策略被命名为FACTOR。如图2所示，Cas12a的顺式剪切能够触发DNA序列的重组，激活原本沉默的基因表达，从而产生多种基于蛋白质的信号输出，如荧光、显色、电化学等。这种创新的策略不仅增强了检测的灵活性和多样性，也为开发新型生物传感器和诊断工具提供了新的思路。

图2 通过无PAM的核酸条形码扩增调控CRISPR基因电路

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-36874-6

核糖开关（Riboswitch）是一种在转录或翻译水平上进行顺式调控的RNA元件，它由两部分组成：一是能够与小分子配体特异性结合的适配子，二是调控基因表达的表达平台。与反式作用RNA和蛋白质调节相比，基于核糖开关识别的传感器只需调整一个DNA模板，即可实现优化，使得操作更为简便。

Alexander A. Green团队开发了一种多功能RNA逻辑门系统，该系统能够在细胞外诊断中广泛应用，特别是在无细胞诊断中检测SARS-CoV-2病毒。该方法巧妙地利用多臂结构在mRNA的5'端形成强二级结构，这种结构遮盖了核糖体结合位点和起始密码子，从而抑制了翻译过程。只有当与之互补的输入RNA结合并展开这一结构后，翻译才能被启动，并通过纸基读出反应实现对病毒的快速和准确检测。

作者设计了一种创新的RNA逻辑门系统，称为LIRAs（Logic-gated Input RNA Activators），这种系统能够在输入RNA序列不受限制的情况下，精确调控蛋白质的表达。通过将LIRAs集成到多臂RNA接头结构中，该系统能够计算并响应细胞内的OR和AND逻辑表达。这些逻辑门RNA的传感器臂由不同的LIRA模块构成，它们能够在输入RNA与逻辑门RNA结合时，触发结构的展开（如图3-1所示）。

图3-1 使用多臂连接实现基于序列独立的RNA逻辑的设计策略

继LIRAs RNA逻辑门系统之后，作者们进一步开发了一种基于纸基的无细胞反应系统，专门用于检测SARS-CoV-2病毒。为了有效扩增SARS-CoV-2基因组中的输入RNA，研究团队设计了一套特定的NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）引物对，通过将唾液样本进行简单的热处理并加入NASBA反应，扩增后的RNA片段随后被应用于纸基无细胞反应系统中（如图3-2所示）。利用SARS-CoV-2 AND门RNA进行检测，该系统展现出了高效区分阳性和阴性样本的能力，并且成功检测到了低至20 aM的SARS-CoV-2病毒浓度，这一检测灵敏度在临床样本检测中具有极其重要的意义。

图3-2 AND门RNA N1N2与SARS-CoV-2阳性和阴性唾液样本一起测试，使用NASBA产物进行2小时反应后的结果。

此外，作者们还在大肠杆菌（E. coli）中对两种输入的OR逻辑门进行了测试。通过流式细胞术的分析，他们发现当任意组合的两种输入RNA被表达时，绿色荧光蛋白（GFP）的表达量显著增加了38至84倍。这一发现证明了OR逻辑门在调控基因表达方面的高效性。更进一步，作者们构建了一个三输入的OR逻辑门，并在细菌体内成功验证了其功能。

这项创新成果不仅彰显了RNA逻辑门在构建复杂基因调控网络中的多输入逻辑电路方面的潜力，而且为合成生物学和生物计算领域带来了一种全新的工具。它能够不受输入序列限制的同时检测多个病毒基因序列，显著提升了检测的准确性与灵活性。

更值得一提的是，该系统还能在纸基诊断平台上得以实现，这大大降低了检测流程的复杂性与成本，使其成为大规模病毒检测的理想选择。为生物技术的广泛应用打开了新的视野，尤其在生物传感器和疾病治疗领域展现出巨大的应用前景。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-022-00857-7

目前，污染物检测的方法大多还局限于实验室内复杂的监测程序，这不仅需要昂贵的设备和专业的技术知识，而且限制了现场快速检测的能力。特别是在资源有限的环境中，这些限制严重影响了对水质的及时检测。为了突破这些瓶颈，满足现场检测的迫切需求，合成生物学家们已经设计出多种基于变构转录因子（allosteric transcription factors, aTFs）的生物传感器。这些生物传感器能够快速、灵敏地检测多种化学污染物，为环境保护和公共健康提供了有力的工具。

美国Julius B. Lucks团队研发了一种创新的无细胞生物传感器平台——ROSALIND（RNA Output Sensors Activated by Ligand Induction），专门用于快速检测水中的污染物。该平台通过运用高度进程化的RNA聚合酶、转录因子（aTFs）以及合成DNA转录模板，实现了对水中特定污染物的灵敏检测。

图4 ROSALIND系统

ROSALIND系统由三个核心可编程组件构成：高度进程化的RNA聚合酶（RNAP）、变构转录因子（aTF）以及合成DNA转录模板。这些成分协同工作，通过变构调节机制控制荧光激活RNA适体的体外转录（IVT）。在目标分析物缺失的情况下，转录过程被阻断；而当目标分析物存在时，系统便会产生荧光信号。这种设计不仅与下游RNA电路兼容，还能调节转录因子输出的特异性和敏感性，从而实现对水中污染物的精确检测。

ROSALIND系统的优势在于它可以被冷冻干燥，便于现场部署，形成一种与样品再水合时激活的水质传感器。这种设计使ROSALIND系统能够在资源有限的环境中快速响应，提供实时的水质监测。此外，通过使用低成本的3D打印手持设备，可以方便地可视化传感器的RNA输出，从而直观地展示检测结果。

ROSALIND的模块化架构允许通过改变aTF-操作子对来开发16种不同的传感器，从而能够检测多种目标分子。这种设计灵感来源于之前的细胞外生物传感器（WCB）方法，并且使用快速的噬菌体聚合酶，ROSALIND系统能够在不到一小时内产生肉眼可见的信号。这使得该系统在实际应用中具有快速响应的优势。

总之，ROSALIND系统以其创新的设计和便携的特性，为水质监测提供了一种经济、快速且易于使用的解决方案。这种系统的开发不仅展示了合成生物学在环境科学中的应用潜力，也为全球水安全挑战提供了新的策略。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-020-0571-7