文献速递 | LNP递送系统的最新进展

背景

在这篇Nature communications文章中，作者在阳离子脂质中引入可降解核，设计了可降解的核-胺-尾配方，通过简单的无溶剂一锅法合成了基于酯核的可电离阳离子脂类（nAcx-Cm）组合文库。其中n表示一个分子中的酯基数量，nAcx表示不同的丙烯酸酯核，m表示脂类中不同的疏水烷基链。

接着作者在卵巢癌细胞系筛选出最佳摩尔比的LNP配方，用于随后的nAcx-Cm筛选。作者发现，具有多个分支链（4 ~ 6）的nAcx-Cm脂质优于具有较少分支链（1 ~ 3）的nAcx-Cm脂质，并且分支上具有单疏水尾的脂质比具有双尾的脂质表现出更高的mRNA递送效率。此外，单尾分支在保持稳定性方面也更有优势。采用荧光共振能量转移（FRET）试验来评估nAcx-Cm脂质融合和内体膜的破坏。结果表明，6Ac1-C12 LNPs介导的膜融合率高于6Ac1-C212 LNPs，说明分支上的单尾移植促进了内体膜破裂。作者还发现适中的尾巴长度（约为C12）有助于提高mRNA的递送效率，其中6Ac1-C12脂质效果最为突出，配制的LNPs在全身给药后的肝脏中使大约98%的mRNA表达。

为简化LNP系统并提高肺靶向功能，作者设计了由nAcx-Cm脂质、永久阳离子脂质、PEG -脂质组成的三组分（3Comp）LNPs。作者发现，使用不同永久辅助脂质（如DOTAP、DDAB）保持相同的肺靶向性，且该方法在SM-102、ALC-0315和DLin-MC3-DMA 3-Comp LNPs系统中也适用。此外，作者还制定了双组分nAcx-Cm/ PEG -脂质LNPs、四组分（4-Comp）nAcx-Cm/胆固醇/永久阳离子脂质/ PEG -脂质和五组分（5-Comp）nAcx-Cm/磷脂/胆固醇/永久阳离子脂质/ PEG -脂质LNP，但双组分LNPs无法介导mRNA在体内的表达，而4-Comp和5-Comp LNP效果不如简化的3-Comp肺LNPs。此外，作者还发现从6Ac1-C12肝脏LNPs中去除胆固醇会导致肝脏mRNA表达减少，同时增加向脾脏的递送。

为研究特异性靶向的内源性机制，作者分析了不同LNPs在血浆中孵育后的蛋白冠状体。与肝脏LNPs相比，3-Comp肺LNPs吸附的脂蛋白较少。进一步选择3-Comp和4-Comp肺LNPs进行蛋白冠分析，作者发现从LNPs中去除胆固醇导致脂蛋白包被减少，这可能解释了3-Comp LNP方法的真正肺部靶向作用。值得注意的是，去除胆固醇并不影响这些LNPs的稳定性，并且所有的这些LNPs在储存30d后保持不变的尺寸。

在这篇文章中，作者设计了由nAcx-Cm脂质、永久阳离子脂质、PEG -脂质组成的三组分LNPs，这种LNPs在功效和肺输送的靶向性方面优于含胆固醇的四组分或五组分LNPs，同时保持了显著的稳定性。同时，这种针对肺部的配方策略对其他现有的阳离子脂质和LNPs具有普遍性，为未来精准mRNA药物的发展奠定了基础，有助于实现更高效且副作用更小的治疗方式。

nAcx-Cm组合文库

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-50093-7

在内体中快速水解的LNP（RD-LNP）能够在溶酶体分解mRNA之前从内体逃逸，有潜力解决传统LNP的内体逃逸问题。此外，RD-LNP能更快地从细胞中清除以降低其在组织中的毒性和积聚。酸降解脂质（ADL）有很大的潜力产生RD-LNPs，然而开发在pH 6.0-6.8迅速降解的ADL具有挑战性。在这篇Nature Nanotechnology文章中，作者开发了一种新型的可酸降解连接子“叠氮基-缩醛”（azido-acetal），由对位有叠氮酮的苯甲醛缩醛组成，这种结构能够在酸性环境中迅速水解，但在生理pH（7.4）下却能保持稳定长达21天。

作者用azido-acetal连接子合成酸降解聚乙二醇（PEG）脂质1，并用1制成LNPs，称为ADP-LNPs。接着研究了ADP-LNPs是否可以转染HEK 293T细胞，并比较了它们与不可降解的PEG2k -胆固醇偶联物（称为NDP-LNPs）的LNPs的转染能力。结果表明，ADP-LNPs转染HEK 293T细胞时效率很高，用ADP-LNP/荧光素酶mRNA处理的细胞比NDP-LNPs具有更高的荧光素酶活性。此外，ADP-LNPs比NDP-LNPs更有效地逃离核内体，在- 80°C或4°C保存60天后也保持转染效率。随后，作者研究了ADP-LNPs是否可以转染HSPCs。结果显示，在10μg ml⁻¹ mRNA的剂量下，ADP-LNPs在HSPCs转染90%的同时保持60%的细胞活力。此外，作者发现ADP-LNPs可以将Cas9 mRNA和gRNA传递到HSPCs并编辑HSPCs。接着作者研究了ADP-LNPs向小鼠传递mRNA的能力，并与含有二肉豆醇甘油- PEG (sd -LNPs)和NDP-LNPs进行了比较。结果发现，ADP-LNPs主要转染肝脏和脾脏，向肝脏和脾脏传递的荧光素酶mRNA是NDP-LNPs的9倍和4倍。此外，ADP-LNPs在脑组织中转染Cas9 mRNA和gRNA的能力明显优于Std-LNPs，在脑组织中转染的细胞数量是Std-LNPs的5倍。

作者选择阴离子脂质作为工程酸催化水解的第二类脂质，将三个羧酸用azido-acetal连接到胆固醇合成了阴离子脂质2，随后研究了含高摩尔比2的LNPs（ADA-LNPs）特征。作者发现，ADA-LNPs转染HEK 293T细胞的效果明显优于NDA1-LNPs。此外，ADA-LNPs也能够比NDA1-LNPs更有效地将荧光素酶mRNA传递到HEK 293T细胞，并且在细胞中产生的荧光素酶表达水平比NDA1-LNPs高约45-145倍。此外，含有IL-22 mRNA的ADA-LNPs处理的细胞在其上清液中产生的IL-22蛋白是NDA1-LNPs的8-13倍。作者还发现ADA-LNPs能够有效地渗透并破坏核内体，这些结果表明，RD-LNPs可以有效地触发内体破坏，并提高阴离子LNPs的mRNA传递效率。

最后，作者研究了在核内体中进行工程快速水解是否可以提高阳离子脂质的转染效率，合成了酸可降解的阳离子脂质3的LNPs（ADC-LNPs）。作者发现，ADC-LNPs可以更好地向HEK 293T细胞传递mRNA，并且可以渗透核内体并诱导核内体逃逸。此外，ADC-LNPs可有效转染HSPCs，并且毒性很小。ADC-LNPs还能够将Cas9 mRNA和gRNA传递到HSPCs，并在AAVS1基因中产生48%的指数。作者还发现ADC-LNPs能够有效转染肺组织，随后利用ADC-LNPs开发了一种基于向肺输送IL-22 mRNA的急性肺损伤的潜在治疗方法，发现与Std-LNPs相比，含有细胞因子mRNA的ADC-LNPs具有显著优势。这些实验进一步证明了azido-acetal连接子可作为开发RD-LNPs和新型酸降解材料的平台。

虽然RD-LNPs能够在多种情况下提高LNPs的转染效率，但也有局限性。例如，RD-LNPs在给药前需要与还原剂混合，这可能会给临床转化带来挑战。此外，RD-LNPs含有大量的胆固醇，RD-LNPs的累积胆固醇含量可能接近胆固醇饱和点。ADP-LNPs还含有大量的PEG脂质，这些高浓度的PEG脂质可能会引发相分离，可能会限制可以引入RD-LNPs的PEG脂质的数量，这些问题是未来几代的RD-LNPs可改进的方向。

三种新型可酸降解LNPs结构

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-024-01765-4

脂肪干细胞（ASCs）因其免疫调节和组织再生能力而受到广泛关注，但由于野生型脂肪干细胞（WT ASCs）的蛋白质生产能力有限以及免疫调节方面的不足，导致其临床转化效果不佳。在Nature Communications的文章中，作者开发了一系列脂质纳米颗粒（LNPs），以重新编程具有持久蛋白质分泌能力的ASC，以增强组织工程和再生。

受二氢己醇独特性质的启发，作者首先以异甘油酯、异山梨脂和l -山梨醇为起始原料，制备了三种二氢己醇衍生的可电离脂质DIM、DIS和LIS用于递送萤火虫荧光素酶 (FLuc) mRNA。根据发光强度检测了它们在ASCs中的mRNA传递，结果表明DIM比DIS和LIS脂质更有效地传递mRNA，此外，具有羟基尾部的脂质（包括DIM1、DIS1和LIS1）比具有其他疏水尾部的脂质具有更高的mRNA传递能力，其中DIM1 LNPs表现出最高的mRNA传递能力。因此在接下来的研究中，作者选择DIM1T LNPs进行离体ASCs工程化。

与传统的IVT mRNA相比，saRNA可以在细胞内自我复制,并在较低剂量下持续产生所需蛋白质高效的表达。作者将saRNA代替mRNA加入到DIM1T LNP，用于ASC工程化，从而诱导持续的蛋白质生物合成。作者发现saRNA处理的ASCs中PKR、eIF2α及其磷酸化衍生物在细胞内表达急剧增加，表明saRNA产生的dsRNA中间体在ASCs中触发了PKR/eIF2α介导的翻译抑制。为避免这种抑制，作者将FLuc-saRNA和编码免疫逃避（VACA）蛋白E3的mRNA包埋在不同saRNA/mRNA质量比的DIM1T LNPs中，结果发现E3-mRNA的共递送显著增强了saRNA对荧光素酶的表达，且在质量比为0.5时诱导的发光强度最高。此外，使用DIM1T LNPs共同递送saRNA/E3 mRNA复合物不会改变工程ASCs的表型或分化潜力。

为研究DIM1T-SEC LNPs工程的ASCs在糖尿病皮肤伤口中的治疗潜力，作者构建了编码肝HGF的saRNAs来产生治疗性高分泌蛋白的ASCs，作者将ASCs用DIM1T-HGF mRNA（DM）或DIM1T-HGF SEC处理12小时，然后收获并包封在水凝胶中，创面形成后将DIM1T工程的ASCs包埋在创面上方。结果显示，HGF DS-ASCs处理组的伤口愈合效率显著高于其他组。同时，该组伤口显示出更有效的再上皮化，形成了良好的增生表皮，且血管化增强，CD31+血管的密度高于其他组。此外，HGF DS-ASCs组的αSMA+成肌纤维母细胞数量显著增加，显示出更活跃和高效的愈合过程。

除HGF外，CXCL12是一种免疫调节趋化因子，可以结合在伤口部位的免疫细胞和角化细胞上表达的C-X-C趋化因子受体4型（CXCR4），从而减轻局部炎症，促进血管生成和细胞增殖。作者比较了HGF和CXCL12在糖尿病伤口愈合中的治疗效果。结果发现CXCL12 DS-ASCs显著加速愈合速率的同时减少了创面大小，且比HGF组创面更小、愈合更快，并且在伤口闭合部位显示出明显更厚的表皮层，CD31+血管和αSMA+肌成纤维细胞的密度也明显更高。值得注意的是，与HGF DS-ASCs和WT对照相比，CXCL12 SEC工程的ASCs显著减轻了伤口部位的局部炎症失调。接着作者研究了CXCL12和HGF在伤口愈合中的潜在协同作用，结果发现CXCL12与HGF联用在促进创面愈合方面缺乏协同治疗效果。此外，作者还评估了性别差异对糖尿病伤口愈合率的潜在影响，没有发现由于性别差异而导致的伤口愈合动力学的任何显著变化。

在这篇文章中，作者研发了一种以DIM1T LNP为基础的平台，有效的增强了脂肪干细胞（ASCs）的蛋白质分泌能力，特别是对于在糖尿病皮肤创伤模型中促进伤口愈合的能力。通过与saRNA和E3mRNA共同递送，实现了对治疗蛋白（如HGF和CXCL12）的持续分泌。这项工作为治疗糖尿病足溃疡等创伤愈合障碍开辟了新的方向，为ASC基础的细胞治疗谱系提供了新的可能性。

LNP工程的ASCs用于糖尿病伤口愈合

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-45094-5