文献速递 | AAV-CRISPR介导的体内基因编辑专题

背景

近日，冯波团队在 Nature Communications 期刊发表了题为：Low-dose AAV-CRISPR-mediated liver-specific knock-in restored hemostasis in neonatal hemophilia B mice with subtle antibody response 的研究论文^[1]。

在临床前模型中，AAV-delivered CRISPR/Cas9（AAV-CRISPR）已显示出在体细胞组织中有效插入治疗基因序列的巨大潜力。然而，所需的 AAV 输入剂量过高，会存在严重的毒性风险。因此，研究团队在 mAlb 3'UTR 的一个新目标位点进行了 AAV-CRISPR 介导的同源无关（NHEJ）基因敲入，单剂AAV成功在成年和新生血友病B型小鼠中实现了人源F9基因的长期整合和表达，产生了高水平的人凝血因子因子Ⅸ（hFⅨ），并在整个48周的观察期间稳定地恢复凝血功能。

图1 AAV-CRISPR 介导的mAlb基因座近端 3'UTR 的 NHEJ 敲入支持成年血友病 B 小鼠的长期 hFIX 产生和止血纠正。

此外，团队还通过使用高活性 hF9^R338L 变体敲入肝脏特异性基因，以更低的 AAV 剂量恢复了止血功能(2 ×10⁹ vg/新生儿和1 × 10¹⁰ vg/成年小鼠)。并且发现在接受低剂量AAV-CRISPR的新生小鼠血浆中，抗Cas9和AAV的抗体几乎可以忽略不计，这为开发AAV-CRISPR介导的体细胞基因敲入治疗遗传性疾病提供了支持。

图2 通过低剂量 AAV 输入，肝脏特异性敲入 hF9^R338L，纠正了 mF9-/- 新生儿小鼠和成年小鼠的止血功能。

这项研究解决了开发基因编辑疗法的关键问题，证明了体内 NHEJ 基因敲入的治疗潜力，并探索了临床转化的可行性。虽然还需要更多的研究来评估与基因编辑相关的长期风险，并解决剩余的挑战，但AAV-CRISPR介导的基因敲入疗法有望治愈许多目前无法控制的疾病。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-34898-y

2022年6月，研究人员在 Nature Biotechnology 期刊上发表了题为：In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice 的研究论文^[2]。

体外工程化 B 细胞的移植可分泌广谱中和抗体 (bNAbs)，已在疾病模型中显示出疗效。然而，这种方法的临床转化需要专业的医疗中心、高技术要求的方案以及供体细胞和受体的主要组织相容性复合体相容性。基于此，该研究使用两种AAV同时递送 CRISPR-Cas9 基因编辑系统和靶向免疫球蛋白基因的修复模板，其中一种载体编码金黄色葡萄球菌 Cas9（saCas9），另一种载体编码抗艾滋病毒 bNAb 3BNC117（图 1a）。作者的设计有助于破坏内源性 IgH 基因座，并使 bNAb 最初表达为膜性 BCR。这样，工程 B 细胞就能在与抗原结合时被激活，进而分化为记忆细胞和浆细胞（图1）。

图1 将抗体靶向 B 细胞的 IgH 基因座，促进抗原诱导的活化、SHM、CSR 和亲和力成熟。

在注射了bNAb载体和saCas9载体的所有小鼠中，3BNC117表达细胞的率在后期免疫后达到了血液B细胞总数的0.5%，而在注射了PBS或仅注射了bNAb载体的小鼠中则没有达到（图2a）。小鼠在最后一次免疫后 8 天，即第 136 天安乐死时，脾脏中多达 23% 的浆细胞（图 3a、b）和 5-10% 的生殖中心淋巴细胞表达了 3BNC117（图 3c、d）。可见该方法能直接编辑小鼠内源 B 细胞的免疫球蛋白基因位点，有效地在体内修饰 B 细胞，使之能产生针对 HIV 病毒的中和抗体，让一次性注射治疗艾滋病成为可能。

图2 体内改造 B 细胞以表达抗 HIV bNAb。

图 3 注射 AAV 130 天后，在淋巴组织中发现了体内工程 B 细胞。

引发针对高变异病毒的特异性中和抗体反应是医学领域的长期挑战。B 细胞工程为表达所需的治疗性抗体以产生适应性免疫提供了机会。作者在本文中证明了 B 细胞可以在体内安全且稳健地进行工程改造。小鼠中单次注射全身剂量的编码 CRISPR-Cas9 和供体盒的双 AAV-DJ 可实现位点特异性整合，同时限制脱靶效应和 DNA 双链断裂。在免疫接种中，工程化的 B 细胞经历抗原诱导的激活，从而导致记忆保留、克隆选择和分化为以中和水平分泌 bNAb 的浆细胞。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01328-9

2023年5月，哈佛大学David Liu实验室在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Efficient prime editing in mouse brain, liver and heart with dual AAVs的论文。要实现引导编辑在研究和治疗遗传疾病方面的前景，需要有效的方法在体内递送引导编辑器（PE）。文章对PE的体内递送体系进行了系统性优化，最终可通过双AAV递送系统实现PE在小鼠体内多组织的高效精准编辑^[3]。

为了通过 AAV 递送 PE，研究人员将 PE 的编码序列分成两半，一半包含 PE 的 N 端，另一半包含 C 端，每半分别与来自Nostoc punctiforme 的 N 端或 C 端内含肽融合。研究者还对与内含肽直接融合的Cas9 N端末端氨基酸进行突变筛选和优化，找出编辑效率最优的变体。随后研究者添加W3序列（WPRE信号的迷你版本）进一步增强蛋白表达效果。PE-AAV表达载体构建完成后，研究者选择AAV9血清型病毒在P0小鼠中通过侧脑室注射（ICV）的方式开展体内Dnmt1基因的编辑研究。证明了通过 AAV 递送时在哺乳动物大脑中可行，并且在这种情况下添加 W3 对于实现大脑中甚至低水平的大量编辑至关重要。带有 W3 的 EFS 驱动的双 AAV 系统（图1b）在下文中称为“v1 PE3-AAV”。

图1 组织培养中分裂 PE 的初步发展以及 AAV 介导的体内先导编辑。

研究采用眼眶后注射（RO）对6-8周龄C57BL/6小鼠进行体内编辑，结果显示v1 PE3-AAV在小鼠肝脏、心脏和骨骼肌中并无明显的编辑效率，因此需要进一步优化。优化两代后的v3em PE3-AAV体系并结合双AAV递送系统，在小鼠大脑皮层/海马神经元以及肝脏细胞中实现了保护性点突变的高效精准编辑。研究还证实，双AAV系统介导的v3em PE3-AAV体内编辑体系并无明显的脱靶风险和毒性效应，证实了新体系的有效性和安全性（图2）。

图 2 体内进行先导编辑以安装Pcsk9 Q155H 及其对血浆胆固醇水平的影响。

目前，体内 AAV 介导的引导编辑需要使用两个或更多个 AAV。对于需要额外蛋白质的 引导编辑应用，例如为基因大小的基因组插入安装位点特异性重组酶着陆位点。进一步减小组件的尺寸可以促进双 AAV 策略。组件尺寸的大幅减小可能使单 AAV 引导编辑成为可能，这将进一步简化使用并增强治疗相关性。并且提供瞬时递送的其他改进，例如脂质纳米颗粒 (LNP) 或病毒样颗粒 (VLP)、PE 的时间控制表达以及进一步增强的效力，可能会提高体内先导编辑的安全性。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-023-01758-z

多种神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病 (AD)、帕金森病 (PD)、亨廷顿病 (HD) 和肌萎缩侧索硬化症 (ALS)，都可以由基因突变引起，并且具有相似的特征，即年龄依赖性和选择性神经元丢失。在这些疾病中，HD 是常染色体显性遗传且完全渗透的。因此，HD 是使用基因编辑工具生成动物模型以研究疾病发病机制和开发年龄依赖性神经退行性疾病治疗方法的理想模型。HD 是由亨廷顿基因外显子 1 中的胞嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤 (CAG) 重复扩增引起的，代表一类多聚谷氨酰胺 (polyQ) 疾病。扩增的 CAG 重复序列转化为扩增的 polyQ，并且还与其他八种神经退行性疾病有关。2023年2月，李世华教授团队在Nature Biomedical Engineering上发表题为 Cas9-mediated replacement of expanded CAG repeats in a pig model of Huntington’s disease 的研究论文 。该工作利用AAV病毒载体表达CRISPR/Cas9基因编辑的技术修复及敲除亨廷顿猪模型的突变基因，首次在国际上证明基因治疗能 为症状^[4]。

作者展示了在基因工程猪体内用正常的 CAG 重复序列替代突变 HTT 等位基因中扩展的 CAG 重复序列的可行性，模拟了 HD 患者的选择性神经变性。只需颅内或静脉注射一次编码Cas9的AAV、靶向HTT基因的单导RNA和含有正常CAG重复序列的供体DNA，就能清除动物体内的突变型HTT，并大大减少突变型HTT的表达失调、神经毒性和神经症状。运动功能障碍和缺陷是 HD 患者的表型特征，在 HD KI 猪中也能看到。研究通过检查 7 个月大（注射后 4 个月）HD KI 猪在沙地上的足迹（图1f、g）来评估其步态表现。脑部注射对照 gRNA/Cas9（未经治疗）的 HD KI 猪表现出不规则和较短的步幅，而单次脑部注射 AAV9- HTT -gRNA-20Q/AAV9-Cas9 治疗可改善 HD KI 猪的步态表现（图1f、g）。研究在脑注射HTT -gRNA-20Q/Cas9后将一只 HD KI 猪饲养了 2 年，发现这头猪的跑步机表现与野生型猪没有差异，证实了 CRISPR/Cas9 永久停止了 m HTT表达。脑注射HTT -gRNA-20Q/Cas9并没有影响 HD KI 猪的体重，尽管接受治疗的 HD KI 猪似乎比未接受治疗的猪寿命更长（图1h），这可能是因为神经元和运动功能的改善。

图1 注射 AAV9 HTT -gRNA-RFP-20Q/Cas9的 HD KI 猪脑分析

为了检验 AAV CRISPR/Cas9 的非侵入性和全身性递送是否也能达到治疗效果，研究在出生后 3-7 天通过耳静脉将 AAV9 - HTT -gRNA -20Q 和 AAV9-Cas9（HTT- gRNA-20Q/Cas9）或对照（Ctrl）AAV9-Ctrl-gRNA/Cas9 注射到新生 HD KI 猪体内 。新生猪所需注射的 AAV 量比成年猪小得多。结果表明，RFP 在脑和周围组织中广泛表达（图2b），表明静脉（iv）注射可使 AAV 有效分布在注射猪的全身。注射猪脑的 RFP 免疫染色一致地显示 RFP 在脑部（图2c）和神经元细胞（图2d）中广泛分布。蛋白质印迹法证明静脉注射的 HD KI 猪在各个脑区表达的 m HTT（<未治疗的 50%）低于未治疗的 HD KI 猪（图2e）。HD KI 猪在疾病早期阶段表现出纹状体的选择性变性。与WT猪相比，对照gRNA/Cas9未处理的HD KI猪的纹状体中NeuN选择性降低，GFAP增加，但在HTT -gRNA-20Q/Cas9处理的纹状体中，NeuN的减少和GFAP的增加发生了逆转（图2e）。此外，与对照gRNA/Cas9未处理的HD KI猪相比，静脉注射的HD KI猪的外周组织也显示出不同程度的m HTT降低.。猪纹状体的免疫组织化学染色也证实HTT -gRNA-20Q/Cas9处理可以显着减少m HTT的积累。跑步机性能测试显示，静脉注射的 HD KI 猪的运动功能优于未经治疗的 HD 猪。沙地足迹测试还表明，静脉注射HTT -gRNA-20Q/Cas9 后，HD KI 猪的步态功能得到改善，证据是足迹不再那么不规则，步幅变化也更少。总之，给新生 HD KI 猪单次静脉注射HTT -gRNA-20Q/Cas9 可显着改善其神经病理学和运动功能。

图 2在 HD KI 猪中静脉输送 AAV HTT- gRNA-RFP-20Q/Cas9 的分析。

通过使用大型亨廷顿氏病动物模型，作者证明了在脑部或外周静脉中单次注射 AAV-CRISPR/Cas9 可有效减少神经退化并改善相关症状。这些发现支持 CRISPR/Cas9 的进一步转化开发，用于治疗亨廷顿氏病和由基因突变引起的其他人类神经系统疾病。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41551-023-01007-3