文献速递 | 基因电路的分型及其应用

背景

基因电路（Gene Circuit）是一种在生物体内或体外构建的人工系统，它利用基因表达的机制来执行特定的功能。这些电路可以看作是生物系统中的“逻辑门”，能够对细胞内外的信号做出响应，并产生特定的输出。基因电路的设计和构建是合成生物学的一个重要领域，它涉及到对DNA序列的精确编辑和调控。其输入信号可以包括化学信号、物理信号（如光、温度、压力）以及生物信号（如特定的蛋白质或代谢物）等。同时不同的基因电路还可以相互结合使用，组成更加复杂的生物学网络，用于实现更高级的功能，如细胞行为调控、药物合成、疾病治疗等。根据其功能、结构进行分类，主要分为以下几类：

1. 开关型基因电路；

2. 反馈型基因电路；

3. 振荡器型基因电路；

4. 传感器型基因电路；

5. 逻辑门型基因电路。

本文将主要对上述几项基因电路及其应用进行总结分析。

核糖体开关（Riboswitch） 是一类调控基因表达的顺式调控元件，它们位于信使RNA（mRNA）的5'-UTR（5' 非翻译区）中，并且能够直接与小分子代谢物结合，从而调控下游基因的转录或翻译。这种调控方式依赖于RNA本身的结构变化，而不需要蛋白质因子的参与，因此核糖体开关是一种独特的基因表达调控机制。

其中，在该领域，Alexander A. Green的研究团队在核糖体开关（Riboswitch）的设计和应用方面取得了显著的进展。其团队研究侧重于开发可编程 RNA 控制元件，如Toehold 开关和新型核糖体开关，用于基因调控和实际疾病诊断中（Cell.2016.165:1255-1266；Nature.2017.548:117-121）。

目前该领域也在不断创新与蓬勃发展，最新的一篇相关文章构建了一类START（合成跨作用核糖体开关与触发RNA）平台，可以用于细菌中响应配体信号的基因调控系统。START平台结合了天然核糖体开关与合成生物学中常用的Toehold switch，通过将RNA适体与特定的小分子配体（如茶碱、四环素、MS2蛋白）结合，从而触发下游基因的表达调控。其中，START的独特之处在于其模块化设计，该设计将配体感应和基因表达控制分离开来，从而提高了系统的灵活性和可编程性。同时研究中通过合理优化RNA序列，展示了该平台在不同环境下的适应性，达到了高达67.29倍的基因表达变化。此外，START平台还可以与布尔逻辑门（OR、AND、NOT）相结合，实现复杂的基因电路调控，为合成生物学中的多重输入信号处理提供了新的工具。

图1：START设计示意图

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/advs.202402029

第二类主要为反馈型基因电路，这类电路通过反馈机制使基因表达在某种输入信号下能够自我调节，从而实现对生物系统中复杂行为的控制，被广泛用于稳态维持、振荡行为和信号放大等功能的合成生物学应用中。下文绍了一种基于CRISPR-Cas自催化反馈放大网络的超灵敏DNA诊断平台-CONAN。该平台利用CRISPR-Cas系统的精准性和高特异性，结合自催化反馈机制，显著提高了对目标DNA的检测灵敏度。

该文章设计网络通过引入Cas12a核酸酶，该酶在识别到目标DNA后，能够被触发其切割活性，并通过反馈回路持续放大信号。其设计关键在于Cas12a在切割目标DNA的同时还会激活额外的酶活性，能够切割旁路的报告探针，从而进一步进行放大信号输出。这种设计极大地增强了系统对低浓度目标DNA的检测能力，可以在极低的DNA浓度下生成可读信号，使得该平台具备超灵敏的检测性能，为开发下一代高灵敏度DNA检测工具提供了重要的技术支持。

图2：Cas12a自催化正反馈电路原理示意图

原文链接：https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.abc7802

第三类主要为振荡器型基因电路，其通过反馈机制实现周期性基因表达。该电路的核心特性主要是能够在不同的时间点自动切换基因的表达状态，形成类似于钟摆或波动的行为。这类电路在模拟生物体内的自然振荡过程（如昼夜节律、细胞周期）以及合成生物学应用中有着广泛的应用。

近期在Science上发表的一篇文章探讨了一种用于延缓细胞衰老的合成基因振荡器的设计，该基因振荡器旨在通过周期性调控细胞内的基因表达，延长细胞寿命。在该实验中，该研究团队主要通过工程化的方式构建了一个合成的基因振荡电路，其能够定期激活与抗衰老相关的基因，并抑制加速衰老的信号通路。其中，该设计主要的核心设计依赖于负反馈和时间延迟机制，这些机制确保了抗衰老基因表达的周期性振荡。例如，通过定期激活抗氧化酶、修复DNA的蛋白质或减少代谢副产物的积累，基因振荡器能够有效减缓细胞内损伤的累积。同时这种周期性的激活方式能够有效避免抗衰老因子的持续过量表达，防止可能产生的副作用，最大化其延长寿命的效果。最终实验结果也表明该合成基因振荡器在模型生物中显示出显著的细胞寿命延长，并减缓了与衰老相关的标志性损伤。这一研究不仅为延缓衰老提供了新的方法，还为未来的抗衰老治疗和合成生物学的应用提供了重要参考。

图3：基因震荡调控模型

原文链接：https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/science.add7631

第四类主要为传感器型基因电路，其能够检测环境中特定信号或分子，并据此调控基因表达合成生物学工具，被广泛应用于环境监测、疾病诊断和代谢工程。

以下文章介绍了一种无细胞生物传感器，通过将基因编码的核糖开关（Riboswitch）与脂质双层膜结合开发了一个能够检测氟化物的小分子生物传感器。

该传感器主要原理是基于转录调控核糖体开关，当氟化物与核糖体开关结合时，开关结构发生变化，从而触发荧光蛋白或其他报告基因的表达。实验结果表明，调节囊泡的膜组成可以改善传感器的灵敏度和对外部信号的透过性，从而实现对氟化物的精确检测。此外，包裹在囊泡内的传感器在复杂实际环境中仍然能够保持稳定，能够抵抗来自外界的降解酶等干扰，可以在实际应用中能够精准检测氟化物浓度。此外，通过整合荧光读出与比色分析，该系统为低成本、可定制的环境和生物传感器开发提供了新的可能性，并展示了无细胞生物传感器在复杂环境中的广泛应用前景。

图4：无细胞生物传感器示意图

原文链接：https://www.science.org/doi/epdf/10.1126/sciadv.add6605

逻辑门型基因电路主要是通过模仿计算机中的逻辑门行为，来实现对基因表达的精确控制。逻辑门型电路利用输入信号的组合来决定输出结果，类似于数字电路中的与门（AND）、或门（OR）、非门（NOT）等，能够对多个输入信号进行复杂的处理。

近期发表在Cell上的工作提出了一种名为TriLoS（基于三态缓冲器的逻辑合成）的新框架，用于在哺乳动物细胞中设计和构建多层基因网络。这些网络能够执行复杂的布尔逻辑计算，并且可以映射到活细胞中。TriLoS框架的核心是使用三态缓冲器而不是传统的逻辑门作为基本的信号处理单元。其中，三态缓冲器具有独特的架构，包括一个上游开关直接控制下游开关的连接性，从而实现高效的数据传输，与传统的二元逻辑（开/关）不同，三态逻辑系统引入了第三种状态，即中间表达水平。这种设计允许基因网络处理更多的输入信号，并生成更多的输出状态，极大地提高了调控的灵活性。同时，该研究还在细胞水平上构建了执行全加器和全减器操作的计算基因网络，描述了一种基于可编程细胞治疗的治疗范式，允许植入的细胞治疗在体内根据疾病特异性调整和分泌药物，合成生物学和现代生物医学中精确控制活细胞或生物体提供了新的工具和策略，为慢性病治疗开辟了新的道路。

图5：TriLoS三态门设计及逻辑运算示意图

原文链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(24)00716-5