本课题组常年全球招募具有化学、材料、生物和医学等相关背景的副研究员、助理研究员、博士后和科研助理
联系方式：宋杰老师：sjie@sjtu.edu.cn
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病毒的动态特性导致出现了越来越多的可传播和具有免疫侵袭性的变种，从而导致现有疫苗的有效性下降。因此，人们迫切需要 "下一代 "抗病毒疫苗。目前，推出的第二代 SARS-CoV-2 疫苗可以增强 Omicron 变体的免疫力。Pamela J. Bjorkman 及其同事巧妙地设计出镶嵌式纳米颗粒，呈现出 60 个随机排列的受体结合域 (RBD)，这些受体结合域来自 SARS-CoV-2 和七种沙棘病毒。这些镶嵌疫苗由自组装蛋白组成，形成足球状结构，并饰有异型 RBD，可针对一系列沙巴病毒提供广谱体液免疫保护。尽管已有关于其重要性的线索，但镶嵌纳米粒子上异型抗原的模式和比例究竟如何影响疫苗诱导免疫的程度和交叉保护，在很大程度上仍未得到探索。特别是目前还没有任何方法能在疫苗框架上实现高度可编程和准确地显示各种抗原。本文作者提出了一种基于 DNA 纳米技术的异型抗原空间组装策略，以指导镶嵌式纳米粒子疫苗的合理设计。通过利用对原始 SARS-CoV-2 穗状三聚体和 Omicron 受体结合域具有正交选择性的两种适配体以及 DNA 足球框架，精确地操纵了异型抗原的间距、配比和总体分布，从而创造出具有平均、双极和单极抗原分布的镶嵌式纳米粒子。系统的体外和体内免疫学研究表明，与双极和单极分布相比，30 种异型抗原的等比例平均分布能产生更多的广谱中和抗体。此外，在纳米粒子上仅增加 5 个 Omicron RBD 抗原（从 15 个增加到 20 个），不仅会降低对 Omicron 变体的中和作用，还会引发过度炎症。这项工作强调了异型抗原的空间位置和比例在其结构-活性机制中的重要性，为合理设计镶嵌疫苗提供了一个独特的视角。
为了指导镶嵌式纳米粒子疫苗的合理设计，引入了一种称为 "异型抗原在纳米级形貌中正交呈现"（hetero-POINT）的组装方法。这种创新方法采用了两种对不同抗原具有正交选择性的适配体和一个 DNA 足球框架。利用这种 DNA 框架，可以以纳米级精度精确排列原始 SARS-CoV-2 穗状三聚体和 Omicron RBD。（图1）
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图1 异质-POINT 构建针对 SARS-CoV-2 的镶嵌纳米粒子疫苗的示意图
模拟实际病毒的形态和大小，构建一个直径约为 74 nm 的 DNA 足球状框架（DSF）（图 1a）。随后，通过与相应的稳定链杂交，将两种特异性适配体整合到 DSF 表面的指定位置。为确保两类抗原之间的无干扰附着，需要确定两种具有正交结合选择性的适配体。一种适配体应专门针对原始的 SARS-CoV-2 穗状三聚体，避免与 Omicron RBD 结合，而另一种适配体应专门针对 Omicron RBD，不与原始的穗状三聚体结合（图 1b）。为了研究异型抗原对疫苗效力的影响，增加了 Omicron RBD 的比例。此外，在小鼠模型中采用了肌肉注射和鼻内给药的联合免疫策略，以利用异型抗原递呈纳米粒子潜在的协同免疫激活作用（图 1d）。然后利用血清和支气管肺泡液对原始 SARS-CoV-2 和 Omicron 伪病毒进行交叉中和试验，评估这些镶嵌纳米粒子引起的体液和粘膜免疫反应。
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图2 发现对原始 SARS-CoV-2 穗状三聚体和 Omicron RBD 具有正交选择性的两种适配体
通过异型-POINT 策略精确排列异型抗原需要无交叉反应和高效的抗原组装。采用非 RBD 结合型适配体 SP6，与原始的 SARS-CoV-2 穗状三聚体特异性结合（图 2a）。SP6 拟合物与 SARS-CoV2 穗状三聚体有明显的结合，而与 Omicron RBD 的结合却微乎其微（图 2b）。使用 CoV2-4C 合体组装的 Omicron RBD 与 SARSCoV-2 穗状三聚体相比，信噪比增加了近 20 倍（图 2c）。通过使用流式细胞仪分析 DNA 与抗原修饰珠的结合，SP6-SARS-CoV-2 穗状三聚体和 CoV24C-Omicron RBD 的解离常数（Kd）分别为 102.4 ± 7.3 nM 和 49.9 ± 10.6 nM（图 2d、e）。此外，还进行了交叉竞争实验来评估这两种适配体的正交选择性（图 2f、g）。用生物素化的 SP6 合酶在链霉亲和素（SA）珠上预修饰 Alexa 647 标记的 SARS-CoV-2 穗状三聚体。加入过量 2 倍的未标记 Omicron RBD 后，Alexa 647 的荧光强度基本保持不变（图 2f）。同样，当引入过量的原始尖峰三聚体时，经生物素化 CoV2-4C 修饰的 Alexa 488-Omicron RBD 预缀珠的荧光强度降低了不到 9%（图 2g）。这两种适配体被鉴定为具有高结合亲和力和正交选择性的识别元件，可定向组装相应的病毒异型抗原。为了近似模拟 SARS-CoV-2 的大小和抗原组成，在设计的直径约为 74 nm 的 DNA 足球框架（DSF）上组装了 30 种抗原，包括原始的尖峰三聚体和 Omicron RBD（图 3a）。根据测量的五边形和六边形边长，计算出五边形和六边形相邻点之间的间距（图 3b）。采用一锅热退火法，得到了一个近似球形的 DSF，由 7560 个核苷酸（nt）的单链支架 DNA 和 360 个短链寡核苷酸组成。每个具有特定延伸序列的适配体（CoV2-4C-L1 和 SP6L2 适配体探针）都能与 DSF 上相应的外延手柄链（分别为 L1 链和 L2 链）杂交，以实现精确组装。通过调整 L1 和 L2 手柄链的比例，可以很容易地获得特异性适配体引导的纳米阵列。为了研究 Omicron RBD 与 SARS-CoV-2 穗状三聚体之间的空间距离对免疫反应的影响，设计了一系列 SARS-CoV-2 镶嵌纳米颗粒，其中包含多种异型抗原模式，包括平均（A）、双极（BP）和单极（UP）分布。在A-O15-S15、BPc-O15-S15和UP-O15-S15镶嵌纳米粒子上，每种类型的15个抗原相邻排列，异型抗原平均分布在整个粒子上，分别位于两极或一极（图3b）。而 BPs-O15-S15 嵌合纳米粒子的异型抗原则分别集中在一个极点上。
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图3 通过异质点阵（hetero-POINT）策略组装的镶嵌纳米粒子
在依次与 Alexa 488-Omicron RBD 和 Alexa
647-SARS-CoV-2 穗状三聚体孵育后，所有镶嵌系列的荧光信号强度都明显高于未进行抗原组装的合体功能化 DSF（图 3c）。由于A-O15-S15、BPc-O15-S15、UP-O15-S15和BPs-O15-S15中异型抗原的数量相同，因此它们在两个荧光通道中的强度高度相似。与上述纳米粒子相比， A-O20-S10 纳米粒子的 Alexa 488-Omicron RBD 增加了 5 个，Alexa 647-SARS-CoV-2 穗状三聚体减少了 5 个，因此 Alexa 488 的强度相应地略有增加，而 Alexa 647 的强度则有所下降。还利用原子力显微镜（AFM）成像技术，按照设计的图案分析了镶嵌系列抗原的形态结构（图 3d）。与裸DSF相比，所有开发的镶嵌纳米粒子都显示出DNA框架空腔的减少，进一步表明SARS-CoV-2异型抗原的成功组装。由于 SARS-CoV-2 穗状三聚体的尺寸较大（约 13 nm），平均分布式 A-O15-S15 纳米粒子含有更多的 SARS-CoV-2 穗状三聚体，与 A-O20-S10纳米粒子相比显示出更多的空腔。此外，当异型抗原组装到 DSF 的单极或双极区域时，抗原的形态显示出明显的极性分布。这些结果表明，异型 POINT 策略可以通过适配体的正交选择性实现异型抗原在 DSF 表面的精确排列，从而制造出空间精确分布的异型抗原镶嵌纳米颗粒。作者深入研究了由各种镶嵌纳米粒子诱导的小鼠巨噬细胞中与免疫激活相关的蛋白表达和基因分析。为了初步评估整体抗原呈递活动，作者比较了暴露于各种镶嵌纳米颗粒后共刺激标记CD40的表达情况，镶嵌系列比装饰有同型抗原的纳米颗粒（A-O30或A-S30）诱导了更强的免疫反应，巨噬细胞中CD40表达增加了1.3到2.4倍，与DSF和抗原的物理混合物相比，所有在DSF上修饰抗原的纳米颗粒都表现出更强的免疫激活(图4a)。为了进一步探索了镶嵌纳米颗粒结构与免疫活性之间的关系，作者探索了镶嵌纳米颗粒刺激的细胞培养释放的细胞因子，在比较了平均分布但比例不同的情况与相同比例但不同分布的情况，包括 A-O20-S10、A-O15-S15和BPc-O15-S15，作者发现，大多数由镶嵌纳米颗粒刺激所释放的细胞因子比裸露的DSF和同型抗原功能化的DSF有更高的表达水平，在激活针对呼吸道病毒的先天免疫相关的细胞因子时，如干扰素（IFN）-γ, 肿瘤坏死因子（TNF）-α等，浓度有着显著的提升。作者还对用镶嵌纳米颗粒处理20小时的细胞进行了RNA测序（RNA-seq）分析（图4c），发现镶嵌纳米颗粒上异型抗原的不同比例和排列方式会引发不同的免疫反应模式
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图4 SARS-CoV-2嵌合纳米颗粒在小鼠巨噬细胞中的体外免疫研究
作者在体外研究基础上比较由镶嵌纳米颗粒诱导的抗原特异性抗体，在体内小鼠模型中探索了开发的SARS-CoV-2镶嵌纳米颗粒疫苗的免疫原性，比较了由镶嵌纳米颗粒诱导的抗原特异性抗体（图5），作者绘制了小鼠接种时间示意图（图5a），在免疫终点（第49天），收集血清和支气管肺泡灌洗液（BALF），用于后续的免疫效果评估。正如作者预期，所有镶嵌纳米颗粒（A-O15-S15、BPc-O15-S15和 A-O20-S10）在血清中诱导的SARS-CoV-2刺突特异性IgG增加了超过39.5倍，Omicron RBD特异性IgG增加了5.8倍，与接种A-O30的组相比（图5b），接种A-O15-S15的组在BALF中显示出相对较高水平的SARS-CoV-2刺突特异性IgG产生，与接种BPc-O15-S15和 A-O20-S10纳米颗粒的组相比，分别增加了1.7倍和1.3倍。然而，与PBS对照组相比，无论是同型抗原纳米颗粒还是镶嵌疫苗刺激后，BALF中Omicron RBD特异性IgG水平均未显著增加（图5c）。因为所开发的镶嵌纳米颗粒拥有着与自然冠状病毒相似的纳米级直径，表明该结构通过鼻腔高效递送到活跃的黏膜免疫系统有着巨大的潜力，作者量化了抗原特异性血清IgA来评估粘膜对镶嵌纳米颗粒的免疫反应，接种A-S30/A-O30疫苗可产生可检测但中等水平的SARS-CoV-2刺突/Omicron rbd特异性IgA抗体(图5d)，A-O15-S15接种组刺激了最高水平的SARS-CoV-2刺突/Omicron RBD特异性IgA抗体, 尽管纳米颗粒上平均多出五个Omicron RBD， A-O20-S10接种组仍然显示出比A-O15-S15接种组低2.2倍的Omicron RBD特异性IgA。因此，使用hetero-POINT策略构建的镶嵌纳米颗粒表明，异型抗原的比例显著影响抗原特异性IgA抗体反应。为了评估接种小鼠血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的中和抗体水平，作者进行了假病毒中和试验。血清SARS-CoV-2刺突特异性IgG抗体浓度相当，但A-O15-S15、BPc-O15-S15和 A-O20-S10接种组（图5b-c）显示出显著不同的对SARS-CoV-2假病毒的中和反应：A-O15-S15（67.1%）> BPc-O15-S15（51.3%）> A-S30（34.3%）> A-O20-S10接种组（28.9%）> A-O30（25.5%）（图5e）。这可能源于对中和表位的更集中反应以及A-O15-S15接种小鼠血清IgA反应水平的增加（图5d）。在所有接种小鼠的血清中观察到对Omicron假病毒的中和效果降低（图5f）。在测试的镶嵌纳米颗粒中，接种A-O15-S15的小鼠在血清中显示出最显著的中和效果降低（约17.4%），但仍然展示了对Omicron假病毒的最高中和效力（49.7%）。接种A-S30的小鼠BALF对SARS-CoV-2假病毒的中和效果低于20.0%（图5g）。相反，A-O30诱导的中和效果是A-S30的1.3倍以上，突出了在下呼吸道引发保护性免疫反应的潜力。作者研究发现 A-O20-S10中增加的Omicron RBD比例比A-O15-S15（图5e-f）对SARS-CoV-2/Omicron假病毒的中和效果更少。这表明增加Omicron RBD比例不仅减少了中和抗体的产生，还可能触发炎症效应，这可能是由于Omicron RBD与原始SARS-CoV-2相比具有更高的抗原性，表明在合理的疫苗设计中精确调节异源抗原的重要性，特别是在通过准确控制Omicron RBD比例可能减少过度炎症反应。
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图5 接种C57BL/6小鼠的SARS-CoV-2镶嵌纳米颗粒抗原特异性抗体反应
总之，这项工作提出了一种开创性的DNA折纸引导组装策略，称为异型点策略（hetero-POINT），旨在合理化SARS-CoV-2病毒疫苗的设计。这种创新方法利用两种不同的适配体，在纳米尺度的拓扑结构中实现SARS-CoV-2异型抗原的正交排列。作为一个多功能设计平台，这种定向病毒异型抗原组装策略，仅需要引入病毒异型抗原和天然核酸分子，为进行镶嵌纳米颗粒疫苗开发中的机制研究提供了一个强大的工具，对提高疫苗效果具有巨大的前景。
[1] Yang Y, Zhang J, Xu Y, et al. Spatial Engineering of Heterotypic Antigens on a DNA Framework for the Preparation of Mosaic Nanoparticle Vaccines with Enhanced Immune Activation against SARS‐CoV‐2 Variants[J]. Angewandte Chemie International Edition, e202412294.
