背景
硫代磷酸酯修饰是核酸骨架修饰的一种常见化学方法，通过替换RNA骨架中的磷酸二酯键（PO）为硫代磷酸酯键(PS)，从而增强RNA分子对核酸酶的抗性，延长其在体内的半衰期，在核酸药物和基因治疗中具有应用价值。此外，RNA PS修饰，作为一种在原核生物和真核生物中都存在的RNA修饰，在RNA结构和基因表达与翻译调控中发挥着重要作用。本文结合最近的报道，介绍RNA PS修饰的特征及其在siRNA和ASO中的应用。
01
提高核酸酶抗性
由于PS键是手性的，这篇文章 (Nucleic Acids Research, 2022, 50(3): 1221-1240)系统研究了在每条链末端含有单个手性PS键的siRNA的性质，证明反义siRNA链5端的Rp非对映体和3端的Sp非对映体改善了小鼠模型的药代动力学和药效学性质。计算机模拟研究为反义siRNA 5端的Rp异构体和3端的Sp异构体如何协同增强Ago2的负载和siRNA的代谢稳定性提供了机制见解。
表1研究中合成的siRNA的特征 （来源于原文Table 1）
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34268578/
02
提高翻译起始速率
在这篇文章(Angew. Chem. Int. Ed. 2020, 59, 17403 – 17407) 中，制备了对A，G，C和U的磷酸位点进行硫代磷酸酯修饰的信使RNA (PS-mRNA)，并采用大肠杆菌无细胞翻译系统评价其翻译反应。与未修饰的mRNA相比，15种模式中有12种PS-mRNA的蛋白质合成增加。在起始密码子的5′端引入A/C位点的硫代修饰后，蛋白产量提高了22倍。PS-mRNA翻译的单次翻转分析显示，硫代修饰增加了翻译核糖体的数量，这表明修饰对翻译起始率（核糖体复合体形成率）有积极影响。该方法为利用非天然mRNA提高翻译提供了一种新的策略。
图1 PS修饰对原核系统蛋白表达的影响（来源于原文Figure 2）
原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202007111
03
增强siRNA体内功效
治疗性小干扰RNA (siRNA)作为一类寡核苷酸疗法，能够调节致病基因表达。现已开发多种糖和磷酸骨架修饰的siRNA来抑制核酸酶降解。然而，目前唯一临床使用的骨架修饰--硫代磷酸酯(PS)的代谢可能不足以靶向肝外组织。为了提高寡核苷酸的稳定性，本篇文章 (Nat Biotechnol, 2024)报道了在核苷的5’-C和5‘-OH之间插入亚甲基的扩展核酸(extended nucleic acid, exNA)的发现、合成和表征。exNA的掺入采用与经典2‘-OH RNA双链类似的亚磷酰胺合成法，该方法能兼容骨架PS修饰，且exNA-PS组合骨架显著提高了对3′外切酶和5’外切酶的抗性。
在该研究中，使用一组先前鉴定的5个沉默huntingtin (Htt) mRNA的siRNA序列，利用两个exNA磷酰胺，合成了一组siRNA，在每个位置用exNA-尿嘧啶取代尿嘧啶(图2a) ，评估了exNA对siRNA效力的影响。结果表明，在siRNA的某些内部位置插入exNA可能以序列特异性的方式影响总体效力(图2b)。
此外，本文评估了3’-exNA修饰对小鼠血液中寡核苷酸清除动力学的影响。与PS修饰的siRNA (D49) 相比，3’-exNA-PS修饰的siRNA (D50) 的Cmax增加约3倍，AUC0 - inf增加约6倍，平均停留时间增加约2倍（图3c）。这些结果表明，在siRNA血浆循环过程中，3’-exNAs显著增强了3’降解的抗性。另外， PNA杂交实验显示，D50在肝脏、肾脏、肌肉、心脏和脂肪中的蓄积量分别是D49的9.7、4.7、3.5、14.9和8.9倍(图3d)。
图2 exNA修饰对体外siRNA活性的位置依赖性影响（来源于原文Figure 4）
图3 3′- exNA修饰的DCA偶联siRNA的系统递送（来源于原文Figure 5）
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02336-7
04
靶向PCDHA11的ASO治疗胃癌
为了利用靶向原钙黏蛋白α 11 ( PCDHA11 )基因的反义寡核苷酸( ASOs )，开发一种创新的治疗策略，阐明PCDHA11在胃癌细胞中的作用，该研究 (Br J Cancer, 2024,131(9):1555-1566.) 设计并筛选了54个酰胺桥连核酸( AmNA )修饰的ASOs，根据PCDHA11敲低效率、体内外活性和脱靶效应进行筛选，并评估了AmNA修饰的anti - PCDHA11 ASOs对细胞功能和信号通路的影响，研究了Pcdha11缺失对小鼠的影响。
与相应的癌旁正常组织相比，PCDHA11 mRNA在300例胃癌组织中的平均表达水平显著升高（图4a）。高PCDHA11组的总体生存时间和无病生存时间均短于低PCDHA11组，使用两个外部验证数据集也得到了类似的结果(图4b )。
图4 PCDHA11表达的临床相关性。(a)癌症组织表达的PCDHA11 mRNA的平均水平高于相应的正常邻近组织，*P < 0.05。(b)机构、TCGA和Kaplan-Meier绘图仪队列中的预后和PCDHA11表达。
在本研究中，抗PCDHA11 ASO包括AmNA修饰核苷酸的侧翼区域，所有磷酸基团都被硫代磷酰化（图5a）。为了筛选最佳ASO，该研究设计了54条序列，比较它们在癌症细胞系中抑制PCDHA11 mRNA表达的能力。首先，选择hPCDHA11-2382和-3716进行进一步测试。在MKN1细胞中实现了这两种ASO的浓度依赖性敲除效率（图5b）。HPCDHA11 - 2382和hPCDHA11 - 3716抑制MKN1 (分化型胃癌,图5c)和SW1116 (结肠癌)细胞的增殖能力。使用候选的ASO转染子确定与胃癌细胞转移潜能相关的功能变化，如迁移和侵袭。与未转染的对照组和NEG - ASO细胞(图5d , e)相比，转染hPCDHA11 - 2382或hPCDHA11 - 3716的HGC - 27细胞的侵袭和迁移能力显著降低。
图5 候选ASOs，hPCDHA11 - 2382和- 3716，对敲低PCDHA11 mRNA表达，癌细胞的细胞功能和体内肿瘤生长的影响。(a) AmNA修饰的抗PCDHA11 ASOs的结构。(b) h PCDHA11 - 2382和- 3716对PCDHA11 mRNA表达的浓度依赖性敲低效率。（c）h PCDHA11 - 2382和- 3716减弱胃癌细胞的增殖率。当转染hPCDHA11 - 2382和3716时，胃癌细胞系的侵袭( d )和迁移( e )减弱。（来源于原文Figure 2）
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39304746/
05
硫代ASO的结构动力学
反义寡核苷酸（ASOs）为基因产物相关疾病的选择性药理干预提供了突破性的可能性。治疗性ASOs通常需要进行各种化学修饰，以提高酶裂解的稳定性，并调节相对于天然RNA/DNA的结合亲和力。但化学修饰核酸（NAs）的力场参数尚不完善。这篇文章(NAR Genomics and Bioinformatics, 2024)开发了模拟PS骨架修饰ASOs的参数，并将其用于B-DNA、RNA、DNA/RNA杂合双链PS修饰的分子动力学（MD）模拟。
与相应的天然NAs相比，单PS取代对有序DNA/RNA双链的影响微乎其微，而在单链RNA和B-DNA中观察到磷酸化的实质性影响。PS修饰的NAs在高和低扭态之间转换，这可能影响磷酸化寡核苷酸的靶标识别和蛋白质相互作用。此外，与天然寡核苷酸相比，PS修饰的ssRNA系统的构象采样显著改变，表明序列依赖性对构象偏好的影响可能反过来影响双链形成（图6）。
图6 PS修饰（蓝色）和天然（黑色）的(A) 扭曲、(B) 滚动、(C) 滑动和(D) 移位参数分布 （来源于原文Figure 3）
原文链接：https://doi.org/10.1093/nargab/lqae058
总结
本课题组常年全球招募具有化学材料、基因治疗、生物医学和生物信息等相关背景的副研究员、助理研究员、博士后和科研助理。
有意者请将简历发送至宋杰老师邮箱：jiegroup@126.com，或点击此处查看详情。
往期回顾
Nature communications | 由DNA修饰酶驱动的合成分子开关
iScience | 在哺乳动物细胞中掺入非经典Z碱基产生具有最小免疫原性和增强翻译能力的修饰mRNA
M3R Lab
作者｜wy
审核｜sj
排版｜xjc
