专题文献速递 | 核酸的体外合成

背景

采用酶促方法生产核苷酸具有以下优势：1）简化了下游的纯化过程和更好的原子经济性，提供高产量和高纯度的寡核苷酸。2）水基工艺可以消除有机溶剂的大量消耗，防止有害废物的产生，降低寡核苷酸合成对整体环境的影响。近期，发表在Nature biotechnology期刊中的文章《Template-independent enzymatic synthesis of RNA oligonucleotides》，报道了基于水相的酶促合成RNA的平台，该平台能够一次一个碱基的编写天然和修饰RNA寡核苷酸，而不需要模板序列。

整个合成平台进行酶延伸需要三个组成部分：1）3’含阻断基团的可逆终止核苷酸（RT-NTP）。2）催化核苷酸插入的酶。3）初始寡核苷酸引物。可逆终止基团阻止酶不受控制的延伸，并且限制延伸序列为单一序列。初始寡核苷酸的序列和长度可以不同，能够在载体部位替换为一些功能性的修饰，如荧光基团（图1a）。酶合成的典型周期开始于步骤（1），在RT-NTP和酶的存在下对初始寡核苷酸引物进行延伸，形成N+1*的延伸产物，其中N和星号分别表示初始寡核苷酸引物的长度和可逆终止保护基团。随后进行步骤（2），对可逆终止保护基团的脱除，得到无保护基团的N+1延伸产物。之后加入RT-NTP，进行下一个合成循环。最后，在得到完整序列后将寡核苷酸从固相载体中分离下来（图1b）。

选择烯丙基醚作为可逆终止保护基团，合成了A、U、G和C的带有可逆终止保护基团的RT-NTP。探究了这四种RT-NTP进行单循环酶促RNA合成能力（图2）。结果显示初始引物寡核苷酸消失，成功出现N+1延伸产物，并且烯丙基醚基团能够被成功脱除。

按照相同的方法，尝试了使用Cy5标记的引物进行5次可控的酶促合成循环，成功得到了脱保护的延伸产物。同时，将修饰引入底物后发现，该方法能够延伸2’-F和2’-OMe修饰的RT-NTP，但对于PS修饰需要更换可逆保护基团。

总而言之，本文开发了一种可控的非模板依赖的酶促RNA寡核苷酸合成方法。通过模拟固相合成的方式，能够摆脱RNA酶学合成中对模板的依赖，而且不仅仅能够用于天然RNA序列的合成，也可以用于在ASO中常用修饰RNA序列的合成。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41587-024-02244-w

不同于上篇文章的思路，发表在Nature Communications的文章《Expedient production of site specifically nucleobase-labelled or hypermodified RNA with engineered thermophilic DNA polymerases》也报道了通过酶促方法合成碱基修饰RNA的策略。该文章的主要思路是工程化嗜热DNA聚合酶SFM4-3和TGK，在RNA中引入单种或多种修饰核苷酸。

过去常用获得修饰RNA长链的方法是通过体外转录（IVT），但该方法对于一些不兼容的复杂修饰，需要初始序列含有GGG三核苷酸且对于复杂结构RNA容易发生转录提前终止。一些研究显示来源Thermococcus aquaticus（Taq）A-家族聚合酶的SFM4-3或来源Thermococcus gorgonarius B-家族DNA聚合酶（Tgo）的TGK聚合酶都能够合成糖环2’-修饰的DNA或XNA。本文基于此思路，在不同条件下将工程化DNA聚合酶（SFM4-3和TGK）用于合成碱基修饰RNA（图1）。

图1 现有基于工程化DNA聚合酶进行碱基修饰RNA合成的不同方法的比较

作者合成了不同的修饰基团：点击基团（ethynyl，E）、疏水基团（pentyn-1-yl，Pent和phenyl，Ph）、氯乙酰氨（CA）和醛基噻吩（FT）以及含有不同标签的mBdp、Cy5和Cy3等。测试了不同聚合酶变体分别在单个位点和四个位点插入单种修饰核苷酸的延伸情况，TGK和SFM4-3都能顺利延伸至全长。对于不同修饰核苷酸，作者分为三组情况：1）rA^PhTP、rU^PhTP、rC^PhTP和rGTP。2）rA^ETP、rU^BioTP、rC^PhTP和rGTP。3）rA^PhTP、rU^BioTP、rC^mBdpTP和rGTP。对于这三组，TGK都能以高产率获得全长产物，而T7 RNAP只有在第2组底物情况下获得部分全长产物（图2）。

因为TGK的延伸效率优于SFM4-3，采用TGK进行后续研究。为了去除DNA引物，以rATP、rUTP、rCCy5TP和rGTP单体为底物，用含有单个dU修饰的ssDNA为引物进行引物延伸。再用尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）处理延伸产物形成缺碱基位点，DNase最终降解DNA模板（图3A）。为了获得末端带有荧光修饰的多修饰RNA，作者在引物dU位点的下游相邻位置引入含有荧光修饰的dT。基于此，获得了5’末端带有荧光标记的多修饰RNA（(rA^ETP、rC^PhTP、rU^BioTP和rG^PentTP）。

基于此，作者可以实现一锅法对两个不同位点进行位点特异性RNA标记，设计了编码纳米荧光素酶的、含有内部核糖体进入位点的mRNA，成功翻译后能发光。

总之，本文开发了工程化热稳定DNA聚合酶用于修饰RNA合成，能够兼容各种修饰rN^XTP。该方法能够实现引物的无痕去除和5´-末端标记。不同于第一篇文章不依赖于模板的思路，该文章设计了巧妙方法来实现DNA模板的降解，同时能够在5’-末端引入标记。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-47444-9

单链DNA（ssDNA）通常是通过化学固相合成，但固相合成具有成本高，产生有机废物多等缺点。酶促合成ssDNA具有合成步骤简单，成本低等优点，并且合成非常规ssDNA比固相合成更加方便。但在酶促合成中实现ssDNA与相同长度互补链的分离却十分困难。在JACS上报道的文章《Robust Enzymatic Production of DNA G-Quadruplex, Aptamer, DNAzyme, and Other Oligonucleotides: Applications for NMR》中提出“回文切口依赖扩增”（PaNDA）的酶促合成方法，可以简单而又稳定地合成大量的ssDNA。在非变性条件下，通过阴离子交换色谱可以很容易地分离出ssDNA产物。

PaNDA由三种成分组成：1）具有链置换功能的Bst 2.0 DNA聚合酶。2）Nt.BstNBI切口酶。3）输入DNA，其中输入DNA包含一段模板序列和一段回文引物序列。聚合酶延伸DNA引物链并产生双链DNA（dsDNA），Nt.BstNBI切口酶识别模板链中的回文序列，并在识别序列3’端第4和第5个碱基之间产生切口。这个切口允许DNA聚合酶再次进行相同的延伸过程，置换掉先前的ssDNA产物。因此ssDNA通过上述循环过程逐步积累，最后通过阴离子交换色谱进行分离（图1）。

PaNDA方法可以在底物添加带放射性标记的dNTP实现ssDNA的放射性标记，可以通过NMR对于含有G四链体的序列进行表征。作者对22 nt端粒重复DNA G四链体进行验证，该方法可用于DNA适配体是否含有G四链体作为表征。最后，该方法也能对DNAzyme进行快速同位素标记。

综上，本文开发的PaNDA策略，可以简单、快速的制备ssDNA，同时能够进行ssDNA的同位素标记。由于核磁共振在核酸结构表征方面的应用，能够将PaNDA与核磁共振结合实现更迅速的表征。

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.3c11219