文献速递 | 单分子生物物理学: 从方法到应用的前沿进展

背景

甲基-CpG结合蛋白2（MeCP2）在成熟神经元中是一种高丰度的染色质结合蛋白，被鉴定为DNA甲基化依赖性转录抑制蛋白。X-linked MECP2基因的突变会导致Rett综合征 （RTT），这是一种严重的遗传疾病，每大约10,000 名活产女婴中就有1例发生，其特征是进行性神经功能障碍和发育倒退。另一方面，MECP2基因的复制会导致MeCP2复制综合征（MDS），这是另一种主要影响男性的罕见神经发育障碍。目前尚无治愈RTT或MDS的方法，部分原因是MeCP2对染色质的复杂分子功能仍然知之甚少。近期发表于Nature Structural & Molecular Biology期刊上的文章《Differential dynamics specify MeCP2 function at nucleosomes and methylated DNA》使用单分子荧光和力学显微镜技术详细研究了甲基-CpG 结合蛋白 2 (MeCP2)在核小体和甲基化DNA上的的动态行为。

该文中作者使用单分子相关力和荧光显微镜直接可视化DNA上野生型和 RTT 诱导突变体 MeCP2 的动力学。结果发现，与CpG甲基化DNA结合时，MeCP2表现出不同的一维扩散动力学，从而能够进行甲基化特异性活动，例如共阻遏蛋白募集。而在染色质化的DNA上，MeCP2优先定位于核小体并稳定它们免受机械扰动。该文的结果揭示了MeCP2对染色质的多模式行为，这是其DNA甲基化和核小体依赖性功能的基础，并为剖析RTT突变的分子病理学提供了生物物理框架。

图1 a 实验装置示意图。b 与2 nM Cy3-MeCP2一起孵育的未甲基化DNA的代表性运动图。c 未甲基化DNA上的MeCP2轨迹示例，显示它们的扩散运动。d 与2 nM Cy3-MeCP2一起孵育的CpG 甲基化DNA的代表性运动图。e CpG 甲基化 DNA 上的 MeCP2 轨迹示例 。f 未甲基化（黑色）和 CpG 甲基化（蓝色）DNA上的Cy3-MeCP2轨迹的扩散系数。

首先作者将单个λ DNA分子拴在两个光学捕获的珠子之间，保持1 pN的张力，在含有Cy3标记的MeCP2的通道中孵育，然后移动到另一个无蛋白通道进行成像。可以观察到 MeCP2 经常在DNA上表现出长寿命和长程的一维扩散运动（图 1b，c）。MeCP2的迁移率因个体轨迹而异（图 1b，c），这可能归因于局部DNA序列和扩散单元的分子量。根据荧光强度，作者估计每个轨迹包含8.7 ± 7.9个MeCP2分子，表明MeCP2可以在 DNA 上作为寡聚体单位扩散。需要注意的是，如果独立的 MeCP2 单元位于相同的衍射极限光斑 （~300 nm）内，则它们在分析中无法进行空间分辨。MeCP2寡聚化似乎取决于DNA结合，因为根据质谱光度法（MP）结果，该蛋白质主要以单体形式存在于溶液中。作者绘制了扩散系数与每条轨迹的MeCP2分子的估计数量，发现较大的低聚物往往扩散得更慢。甲基化DNA结合的动态更为稳定，这种较低的解离率有助于它有效阻止转录因子的结合，从而长时间维持基因沉默状态。

随后作者的单分子结果进一步揭示了MeCP2-核小体相互作用是普遍且稳定的，这与蛋白质在裸DNA上的动态行为形成鲜明对比。作者提出这种稳定的结合介导了迄今为止被低估的MeCP2核小体定向活性。为了支持这一概念，该研究证明了MeCP2结合本身可以稳定核小体以防止机械解缠。在作者的分析中测量的解开MeCP2结合核小体所需的力超过了转录机制和染色质重塑剂产生的最大力。因此，MeCP2的核小体稳定作用预计将影响基因表达和基因组组织的各个过程。此外，作者发现H1的共结合减弱了这种核小体稳定作用，表明MeCP2对染色质的机械影响受到其他染色质结合因子的调节。

该研究还表明，MeCP2增强了TBLR1向核小体的募集。这一发现与先前提出的“桥接假说”相符，该假说假设MeCP2将共阻遏物复合物募集到异染色质中以发挥其作为全局阻遏物的作用。结果通过证明募集函数利用了MeCP2的差异扩散动力学，具体取决于DNA甲基化状态和核小体占有率，从而增加了这个模型。此外，作者的结果表明，核小体充当“分子海绵”，将MeCP2从裸露的DNA位点隔离开来。鉴于MeCP2和组蛋白以接近化学计量的数量存在于神经元核中，核小体捕获了绝大多数MeCP2，只留下一小部分游离蛋白是合理的。因此，即使整体MeCP2水平略有降低或增加，也会严重影响蛋白质的可用性并导致下游功能异常，从而解释了MeCP2尽管丰度高，但其卓越的剂量敏感性。总体而言，该研究强调核小体是MeCP2基因组活动的调控中心。使用该文中的单分子平台研究组蛋白翻译后修饰（如H3K9和H3K27甲基化）如何调节MeCP2在染色质上的行为将会很有趣。

总而言之，作者通过单分子相关力和荧光显微镜的使用揭示了MeCP2在不同染色质环境下的差异化功能，提供了有关MeCP2调控机制的详细见解，帮助我们理解了其在神经发育疾病中的关键作用。这不仅加深了我们对Rett综合征分子机制的理解，还为开发靶向MeCP2功能恢复的治疗策略提供了基础，例如通过调控其结合动力学或增强其特定功能来逆转或缓解疾病症状。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41594-024-01373-9

核小体是染色质结构的基本单位，由组蛋白八聚体组成，其中包含两分子H2A、H2B、H3和H4类型的组蛋白，并包裹大约146个碱基对的DNA，呈1.7圈的螺旋结构。H2A.B是H2A的一种哺乳动物特异性组蛋白变体，在睾丸中及癌症中高度表达，在精子发生、胚胎发生和肿瘤发生中发挥重要作用。此外，H2A.B在活性基因区域、DNA修复位点及DNA复制位点中富集，对基因表达、RNA剪接、细胞周期调控及DNA损伤敏感性有着重要影响。因此，H2A.B核小体可能通过不同于经典H2A核小体的独特机制来调控这些功能。为研究这一点，研究人员需要关注RNA聚合酶在转录过程中从组蛋白上解旋DNA的活性，但可视化这一过程并不容易。最近，已经开发出使用纳米孔测量直接测量 DNA-组蛋白相互作用的技术。这种方法随后被用于揭示组蛋白尾部泛素化对结构稳定性的影响。然而，虽然可以测量DNA从组蛋白中解旋的相对容易程度，但了解详细的分子机制，包括组蛋白八聚体的行为，是具有挑战性的。具体来说，对具有高转录活性的组蛋白变体中的这些分子机制的理解有限。近期发表于Nature Communications Biology 期刊上的文章《Nucleosomal DNA unwinding pathway through canonical and non-canonical histone disassembly》利用固态纳米孔研究 DNA 解旋动力学，在 DNA 和组蛋白之间施加局部力。此外，同步分析和分子动力学模拟对核小体DNA 解旋过程进行了动态分析。

在该文中，作者使用直径小于核小体的固态纳米孔来测量经典H2A和非经典H2A的核小体DNA解旋动力学。随后作者通过分子动力学模拟进行的分析构建了分子模型，包括组蛋白八聚体解离的过程。经典H2A核小体和H2A之间的比较分析。B变体核小体揭示了 H2A中DNA完全解旋的较低电压要求。B变体以较小的力促进展开。此外，同步分析和分子动力学模拟表明，在这两种类型的核小体中，组蛋白八聚体在DNA解旋过程中都会分解。此外，结果表明，在此过程中，H2A.B变体迅速解开DNA，导致H2A-H2B二聚体在组蛋白八聚体被分解后立即从DNA上解离。相比之下，经典的H2A核小体由于其较慢的DNA解旋速率，表明H2A-H2B二聚体在孔中处于堆积状态。这些发现表明H2A中的核小体DNA。B变体经历DNA解旋过程，涉及组蛋白八聚体分解，与经典H2A核小体不同，可实现更平滑的解旋。

图 2核小体 DNA 解旋测量装置。a，用光镊解旋 DNA 的示意图。用原子力显微镜测量核小体复合物的稳定性（左二），通过纳米孔测量解旋 DNA（右二），以及在转录过程中在DNA上解旋。b，纳米孔实验示意图。核小体被困在纳米孔中（左），DNA解开（中），只有DNA通过（右）。c，使用DNA和组蛋白之间交联的核小体进行纳米孔测量的概念图像（左）。交联的核小体卡在孔中，因为孔径（5.2 nm）小于核小体。在300 mV纳米孔测量期间电流值的代表性轨迹（右），表明核小体继续在孔中堆积，直到施加倒置电压。

图2b说明了在该实验装置中实现的固态纳米孔构型的示意图。为了研究核小体在纳米孔测量所需的高离子强度下是否稳定，作者通过凝胶位移分析验证了复合物在各种KCl浓度下的稳定性。基于这些结果，选择了250 mM的KCl浓度，表明DNA解离极少或可以忽略不计。然后选择直径约为3-5 nm的孔以从核小体中解旋DNA，并使用介电击穿技术（包括激光蚀刻）（图2b）。为了评估以该孔径结合的DNA且不发生DNA解离的单核小体的通透性，通过使用 5.2 nm 大小的孔径，利用具有组蛋白-DNA化学交联的单核小体在300 mV下进行实验。结果如图2c 中，揭示了单核小体无法穿过孔隙，而是保持在停滞状态，直到施加反向电压。

作者使用固态纳米孔研究了组蛋白中核小体DNA的解旋过程，并通过分子动力学模拟对获得的数据进行了详细分析。H2A. B核小体DNA与解开H2A核小体所需的力相比，以更小的力从组蛋白中解开。此外，这个过程涉及组蛋白八聚体的分解，揭示了H2A核小体和H2A之间H2A-H2B二聚体解离速率的差异。特别值得注意的是在H2A核小体中观察到的孔堆积状态，这是在同步痕迹时观察到的最深的电流状态，该中间状态显示组蛋白八聚体解离，但每个二聚体仍然与DNA结合。在一些MD模拟轨迹中，还观察到DNA解旋而没有分解组蛋白八聚体，但这可能发生在DNA 与组蛋白的解离太快而无法在模拟时间尺度内允许八聚体解离时。这正是在H2A中没有观察到这种状态的原因。这就像快速拉动桌布而不打扰放置在其上的物品。

综上所述，与光学/磁镊或原子力显微镜不同，使用纳米孔的力谱提供了一种强大的工具，可以在接近转录过程中负载的条件下以无标记方式直接测量核小体中DNA和组蛋白之间的结合亲和力。这些实验系统是研究组蛋白修饰和核小体变体如何改变DNA-组蛋白结合稳定性的有力工具，分子动力学模拟的引入提供了强大的支持。这些方法有望超越探测DNA 和组蛋白之间的结合稳定性，扩展到检查DNA结合蛋白（如DNA马达和转录因子）与DNA 结合稳定性的工具。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s42003-024-06856-5

亨廷顿病（HD）是一种致命的神经退行性变，是由位于亨廷顿蛋白（HTT）基因第一个外显子的CAG重复序列扩增引起的，其中疾病的严重程度和发病年龄与CAG重复次数的数量密切相关。含聚谷氨酰胺的HTT蛋白的聚集已被广泛研究。然而，新出现的证据表明，扩增（exp）HTT mRNA的毒性也会导致疾病。首先，即使RNA无法翻译，转录也具有神经毒性。其次，一项全基因组关联研究表明，不间断的CAG重复束的长度，而不是polyQ束的长度，是HD发病年龄的主要决定因素。第三，HD的细胞模型表明，exp HTT mRNA自缔合成核或核周聚集体，从而隔离剪接调节蛋白MBNL1和其他RNA结合蛋白。这些聚集体被认为是由于含有扩增的CAG束的RNA的固有倾向而产生的，即相分离成凝聚物。促进 RNA 聚集和蛋白质螯合的物理特性一直难以研究，因为重复序列采用许多结构。具有12-15个CAG三核苷酸重复序列的RNA形成包含A-A错配的发夹，这些错配可能会“滑入”相反链的替代排列，暴露出数量可变的单链三联体。在模拟中，这些不成对的CAG三联体播种了链间碱基对，这解释了为什么相分离倾向随着CAG三联体的数量而增加。近期发表于Nature Communications 期刊上的文章《Stick-slip unfolding favors self-association of expanded HTT mRNA》利用单分子力谱探测exp HTT mRNA的折叠和去折叠途径解释了exp HTT mRNA的聚集倾向。

为什么神经退行性变上升到36次CAG重复的阈值附近，以及为什么一些CAG扩增突变有毒而另一些则没有，仍然是长期存在的问题。为了解决重复扩增如何改变HTT mRNA的结构特性，该文使用带有光镊的单分子力谱探测了HTT mRNA片段的折叠和展开，该光镊一次检测几个碱基对的展开并解析异质折叠途径。该文的结果显示了CAG碱基对的连续、非合作滑移如何阻碍exp HTT mRNA的完全重折叠。与相邻CCG三核苷酸的“粘性”相互作用稳定了包含未配对CAG重复序列的部分滑脱结构。暴露的单链很容易启动链间碱基配对，支持单链CAG重复序列驱动CAG重复序列RNA 的相分离和聚集的模型。

图 3 具有 7 个 CAG 重复序列的正常 HTT RNA 协同展开。A 与人 HTT 外显子 1 的 CAG 重复区相对应的 RNA 通过 dsDNA 手柄连接到光学捕获的珠子上。B  示例 90 nm/s 时 fHTT7 的拉伸（黑色，S1）和松弛（红色，R1）FEC 显示 11.5 pN 附近的去折叠/复性转变。C 从 eWLC 拟合的主要展开相对于折叠状态之前滑移中间体的等值线长度。D 展开（黑色）和再折叠（红色）转变的力分布。

单分子力谱结果显示，随着CAG重复数的增加，exp HTT mRNA会出现意想不到的动态转变。具有7或12个CAG重复序列的短f HTT mRNA协同展开和重新折叠，表明它们形成明确的发夹。相比之下，具有40个CAG重复序列的RNA几乎只表现出粘滑展开。这种行为的转变表明，缺乏稳定、协同展开的结构有助于在36次CAG重复阈值以上观察到致病性。这种手风琴状的扩张CAG束的解开和重新折叠是由于CAG碱基对的不断滑动和重组，以及新发夹的异质成核引起的。因此，扩展的重复很少完全重新折叠。重要的是，在HTT中，与CAG束相邻的CCG重复序列与扩增的CAG束的许多片段形成稳定的碱基对，从而在动力学上将RNA捕获在各种结构中。作者表明，在exp HTT mRNA中，由CAG-CAG和CAG-CCG碱基对的混合产生的粘滑去折叠有利于扩展结构。一旦重复道扩展到20-40个CAG三联体，它们就很容易与其他exp HTT mRNA分子相互作用。

图 4  HD 中 CAG 重复聚集的粘滑模型

由于该文中测得解开exp HTT mRNA（10.0 ± 0.7 pN）比协同展开较短的发夹需要更少的力，因此作者的结果还解释了为什么对mRNA 施加~13 pN的核糖体很容易通过扩大的CAG束。核糖体或解旋酶的瞬时去折叠可能会增加 RNA 结构的异质性，因为长程碱基对没有足够的时间来再平衡。然而，瞬时去折叠不太可能溶解重复的RNA 凝聚物，因为RNA相互作用网络会在没有完全解离的情况下重塑。在细胞中，RNA动力学可能受RNA结合蛋白和解旋酶的影响，这些蛋白和解旋酶会局部扰乱CAG碱基对。

总而言之，该文描述的单分子平台将有助于探测蛋白质或小分子对包含重复序列的RNA折叠和聚集的影响。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52764-x#Sec10

分子伴侣是细胞的重要组成部分，因为它们通过监督蛋白质的结构质量来保护生物体免受蛋白质错误折叠和/或聚集的后果。70 kDa热休克蛋白（Hsp70）ATP酶家族是伴侣库的核心成员，在进化上高度保守。它的成员执行多种细胞功能，包括展开错误折叠的蛋白质、解析蛋白质聚集体、分解功能性寡聚体以及将蛋白质转位到线粒体和内质网（ER）中。由于它们的作用范围广泛，Hsp70也与许多疾病有关，因此被研究为治疗药物靶点，例如帕金森病和某些癌症。

通过观察蛋白质转位到蛋白脂质体或线粒体中，已经努力通过实验探索Hsp70s的分子机制。在这些批量实验中，明确选择一个模型而不是其他模型是具有挑战性的，这表明需要更精确的技术。单分子检测方法最近为研究Hsp70蛋白的功能提供了可能性。其中，纳米孔已成为单分子分析的强大工具。除了在DNA/RNA测序中的商业用途外，它们还被证明可用于表征蛋白质相互作用和功能。使用单分子皮米分辨率纳米孔镊子，以超高时空分辨率表征了具有核酸底物的运动酶。除了高分辨率外，纳米孔技术还具有与生理条件兼容的优势，并且不需要对所研究的蛋白质进行额外标记。

近期发表于Nature Communications 期刊上的文章《Single-molecule evidence of Entropic Pulling by Hsp70 chaperones》中作者利用纳米孔设置和体内转位通道之间的相似性来研究 Hsp70s 在单分子水平上的物理机制。

Hsp70伴侣是细胞网络的核心组分，可确保蛋白质的结构质量。尽管在蛋白质解聚和蛋白质转位到细胞器等过程中起着至关重要的作用，但它们的物理作用机制仍存在激烈争论。据我们所知，由于缺乏合适的方法，没有实验数据直接证明迄今为止提出的任何模型（Power Stroke、Brownian Ratchet或Entropic Pulling）。作者使用纳米孔（一种强大的单分子工具）来研究Hsp70s的机制。该文中作者证明Hsp70s通过产生强大的力（相当于1 nm距离上的46 pN）从纳米孔中提取捕获的多肽底物，这依赖于Hsp70的大小。这些发现为熵拉机制提供了明确的证据，从而解决了长期存在的争论，并提出了一个控制不同细胞过程的潜在普遍原则。此外，这些结果突出了生物纳米孔在蛋白质研究中的效用。

图 5 设计系统与 Hsp70 介导的体内蛋白质转运示例的比较图示

在作者设计的系统中，可以通过测量逃逸所需的时间来监测不同底物（溶菌素 K238A）从孔中逃逸的情况，这大大促进了Hsp70（此处为细菌同源物DnaK）的结合。对于越来越大的构造，转义事件发生得更快。这些结果不能用Power Stroke或Brownian Ratchet来解释，因此确定了熵拉是控制Hsp70作用的分子机制。使用理论建模，作者估计Hsp70的结合可以将逃逸的能量屏障降低~11-12kB T。

尽管ATP依赖性伴侣的Hsp70家族在所有细胞的不同生物过程中起着至关重要的作用，但迄今为止尚未明确确定它们能够对其底物施加力的潜在物理机制。在这项研究中，作者开发的这种基于纳米孔的系统来模拟由Hsp70s介导的体内蛋白质转运，并在单分子水平上监测体外这一过程。能够发现Hsp70的结合极大地促进了多肽从孔中逃逸。通过将其效果与不同大小的结构域进行比较，作者估计Hsp70细菌同源物DnaK的结合将必须克服的能量屏障降低多达11-12 kB T才能从孔中逸出。在蛋白质输入的背景下，这转化为细胞器膜细胞质侧折叠结构域展开的加速，并且可以解释折叠和展开结构域以大致相同的速率导入的观察结果。

DnaK通过熵拉（~11-12 kB T）所做的功对应于1 nm距离上约46 pN的力，与其他分子马达的贡献相当。例如，ClpX是一种六聚体AAA+蛋白马达，可通过其中心孔展开和穿线蛋白质。因此，单个ClpX亚基使用1个ATP来克服1 nm步长上20 pN的力，相当于~5 kB T 。同样，对于φ29枯草芽孢杆菌噬菌体的DNA包装马达，通过将其平均失速力（57 pN）乘以每个ATP移动的距离（~0.68 nm）来估计~39 pN nm（≈9.8 kB T ）的工作。总体而言，DnaK提供的机械功与涉及生物聚合物穿线的其他分子机器的机械功相当。

总而言之，该实验支持Power Stroke和Brownian Ratchet上的熵拉模型作为Hsp70产生力的分子机制。这是因为在ADP存在下，被动构建体NBDNt也存在观察到的效果，它是不可水解的，并且不会经历任何特异性的杠杆臂构象转变。此外，Brownian Ratchet无法解释该文结果中观察到的大小依赖性。在没有多个结合事件来逐步纠正波动的情况下，对于相同的外加电压，所有构建体都应以相同的速率逃逸。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-52674-y#Sec6