01
基因编辑驱动DNA双链纳米结构构建
丁宝全课题组基于基因编辑系统对双链核酸所具有的序列特异性的精准识别能力，通过将双链DNA与二价催化失活的基因编辑蛋白（dCas）系统折叠，来构建双链DNA-核糖核蛋白（RNP）杂交纳米结构的通用策略。同时，在融合表达的二价dCas蛋白（dCas9和dCas12a）中间的柔性肽链中引入刺激响应性元件，实现对功能基因的高效折叠和响应性释放（图1a, JACS, 2022）。
另外，区别于二价dCas蛋白的策略，Björn Högberg课题组研究了两个 sgRNA 的嵌合体（dgRNA），这些 sgRNA 具有不同的引导序列，研究了在dCas9蛋白的作用下，关于其 DNA 结合功能和环诱导能力，发现dgRNA接头允许双链DNA的远端区域序列靠近，并且dgRNA可以应用于靶向远端基因组区域，对相关基因的表达具有一定的抑制作用。dgRNA诱导双链DNA编程的能力仅需要通过dCas9 和 RNA作用，使其成为重塑各种生物体染色体构象的最小系统。（图1b, NAR, 2024）
图1. 基于二价dCas系统对双链DNA进行可编程设计。
原文链接：a）https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c01760
b) https://doi.org/10.1093/nar/gkae591
02
Cas蛋白在mRNA翻译调控中的应用
以上的策略主要是在双链DNA层面，利用dCas相关蛋白对双链DNA进行编程，从而抑制了双链DNA的转录过程，实现基因表达的调控。另外，也可以利用Cas相关蛋白作用于mRNA水平，干扰翻译过程，从而调控基因表达。基于RNA结合蛋白的翻译调节可用于构建基因回路，但能够有效且正交调节翻译的RNA结合蛋白仍然很少。Hirohide Saito课题组报道了一组Cas蛋白有效地、正交地抑制或激活在5 ' -UTR中含有Cas结合RNA基序的mRNA的翻译过程，该方法将Cas蛋白用作哺乳动物细胞中的翻译阻遏因子和激活因子。研究人员测试了多种 Cas 蛋白在转录后高效抑制靶 mRNA 蛋白表达的能力（OFF 开关，图2a，Nat Commun, 2023）。还使用这些Cas蛋白来激活蛋白质表达（ON开关, 图2b），方法是包含一个“开关反转”模块，该模块将翻译阻遏因子转化为激活因子。通过连接多个cas介导的平移调制器，他们设计并构建了逻辑门和级联基因回路等。此外，发现各种与CRISPR相关的技术，如anti-CRISPR和split-Cas9平台，同样可以被用于控制翻译。
图2. 基于Cas9系统的mRNA表达的ON/OFF开关设计。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-37540-7
03
工程化gRNA的CRISPR/Cas逻辑门调控
随着RNA合成生物学的进步，向导RNA（gRNA）的工程化使CRISPR-Cas系统的条件控制成为可能。然而，实现CRISPR-Cas系统的精确调控以有效调节内部代谢过程仍然具有挑战性。基于此，Jongmin Kim课题组开发了一种强大的 dCas9 调节因子，具有工程化的条件 gRNA，以实现对内源性基因的严格控制。这项工作提出了 RNA 响应的 CRISPR/Cas 调控元件，该元件使用 CRISPR/Cas9 系统能够组成多个输入 RNA逻辑门。
研究人员在 RNA 设计软件和先进计算工具的指导下，通过多次设计迭代对 cgRNA 进行了优化。接着演示了双输入 AND、OR、NOT 逻辑门和三输入 A OR (B and C) 逻辑操作，动态范围高达 130 倍（图3, NAR, 2024）。借助 cgRNA 设计提供的动态可调性，证明了对酶、转录因子和细胞骨架相关蛋白的靶基因表达的精确调控。此外，内源性代谢相关基因（如lacZ和ftsZ）可以以可逆的方式进行调控。
图3. 基于dCas9系统的复杂逻辑门设计。
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkae549
04
Tl-CRISPRi系统的特异性基因调控
我们知道，在不同的生物体中存在多种CRISPR系统，其中最简单的一种是来自化脓链球菌的II型CRISPR系统，II类效应酶的多样性最初仅限于 Cas9 核酸酶，通过计算基因组和宏基因组已经挖掘出包括 Cas12 和 Cas13 的多种变体，与Cas9或Cas12不同，Cas13可以特异性地靶向和切割单链RNA。与需要严格的PAM序列进行靶向的Cas9和Cas12不同，Cas13不需要或只需要很少的PFS序列(protospacer flanking sequences)，从而可以灵活地靶向mRNA。dCas13可以用于通过隔离mRNA的翻译起始区来抑制翻译水平的基因表达，而不会引起本体生长迟缓。
近日，来自首尔大学的研究人员开发了一种合成的可调翻译水平CRISPR干扰（Tl-CRISPRi）系统，该系统基于工程化的gRNA，可精确且可预测地下调mRNA翻译。研究人员利用Tl-CRISPRi靶向多顺反子操纵子（polycistronic operons）中的多个基因，验证了Tl-CRISPRi可以特异性地针对每个顺反子的翻译起始位点，而不会干扰同一转录本中相邻顺反子的翻译（图4, Nat Commun, 2024）。
该结果表明，与传统的Tx-CRISPRi（dCas9系统作用于双链DNA）相比，Tl-CRISPRi可以更特异性地敲低操纵子中每个顺反子。研究人员还发现突变四环和侧翼区域产生dCas9的sgRNA文库产生了具有多样化抑制效率的sgRNA变体。这说明通过突变sgRNA的柄序列来调节RNP复合物形成的效率可以控制CRISPRi的抑制效率。研究人员对茎环、凸起和侧翼序列三个部分进行系统性突变，获得了使靶基因表达水平均匀分布的突变sgRNA，可以在不同的报告基因中表现出稳定的相对表达水平。
图4. 基于dCas13系统的翻译调控平台。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-49642-x
总结
综上，利用CRISPR技术已经使得在DNA转录、mRNA翻译水平上调控基因表达成为可能，但如何利用重编程的gRNA分子激活CRISPR系统，将为编程生物学带来更多可能性，对更加精准的设计复杂的细胞生物计算线路，重建细胞内的基因调控网络具有重要的意义。
本课题组常年全球招募具有化学材料、基因治疗、生物医学和生物信息等相关背景的副研究员、助理研究员、博士后和科研助理。
有意者请将简历发送至宋杰老师邮箱：jiegroup@126.com，或点击此处查看详情。
往期回顾
Nat Biotechnol | 利用CRISPR相关转座酶在人体细胞中进行DNA靶向整合且不产生DSB
Nat Commun | 可编程的seekRNA通过 IS1111和IS110类型插入序列指导靶标选择
Nucleic Acids Res. | CRISPR-Cas工具用于细菌中同时控制转录和翻译
Nat Commun | DNA数据存储中 CRISPR驱动的定量关键词搜索引擎
