专题文献速递 | DNA硫代磷酸酯修饰的最新进展

背景

通过识别DNA或DNA骨架中核碱基的表观遗传修饰来区分自我与非自我是许多原核免疫系统的主要手段。这些系统中最常见的是限制性修饰（R-M）系统，通过修饰自身DNA，将其与入侵者未修饰（非自身）的DNA区分开来，从而使其成为酶降解的靶标。大多数R-M系统对核碱基进行修饰（如胞嘧啶C5、胞嘧啶N4和腺嘌呤N6甲基化），而零星分布于细菌和古细菌中的Dnd系统则对DNA骨架进行修饰。通过多步酶解过程，该系统引入了独特的硫代磷酸酯（PT）修饰，即硫取代了DNA磷酸骨架中的非桥连氧。Dnd系统有两种不同的操纵子：介导自身DNA修饰的五基因的“DndABCDE”和限制入侵DNA三基因“DndFGH”。

早期对三基因限制模块DndFGH的研究表明，它能够优先结合自DNA中PT修饰的共识位点（如5’-GPTAAC-3’或5’-GPTTTC-3’），从而阻止其靶向基因组中附近未修饰的共识位点。这种与PT修饰的自身DNA的结合还能降低DndFGH的ATP酶、异位酶和裂解活性，从而保护自身DNA。自基因组中只有10-15%的GAAC/GTTC共识位点被鉴定为PT修饰，但并未解释其他未修饰的共识位点如何未被DndFGH靶向。先前的研究表明，删除保守的 DndFGH 簇中的任何基因都会显著削弱其限制能力，而删除修饰基因则会导致噬菌体诱导、DNA 修复途径和SOS响应基因的上调。然而，并没有就DndFGH复合体的结构域和进化历史提供清楚的说明。

最近的这篇文章 (Nucleic Acids Research, 2024, 52, 1005–1026) 使用比较基因组学和序列结构分析，发现DndABCDE模块通常在功能上与DndFGH模块分离。修饰模块的核心由编码DNA扫描装置的共同进化基因对组成--DndD/CxC分支ABC ATP酶和带有两个带状螺旋（MetJ/Arc）DNA结合域的DndE。DndE的DNA结合界面的多样化表明目标特异性的多样性。此外，许多系统的DNA胞嘧啶甲基化酶基因取代了PT修饰，这表明DndDE核心可以招募其他核碱基修饰。研究证明，DndFGH是一种独特的反入侵系统，具有几个先前未表征的结构域，包括核苷酸激酶。这些可能会触发其限制性内切酶结构域以响应多种刺激，例如核苷酸，同时阻止入侵者甲基化酶的保护性修饰。值得注意的是，不同的DndH变体包含从多个来源（包括细胞基因组分离系统和移动元件）获得的HerA/FtsK ATPase结构域。因此，这种依赖于HerA/FtsK的新型防御系统，可能会在复制、连接或包装过程中拦截入侵DNA。

图1 DNA硫代磷酸酯修饰机制（来源于原文摘要图）

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkad1213

DNA磷酸化修饰(PT)作为一种原核生物的表观遗传标记，可以参与细菌防御系统、抗氧化应激和基因调控。PT修饰可以被PT依赖性限制性内切酶(REases)的硫结合域(sulfur-binding domain, SBD)特异性识别，使其成为生物技术开发的潜在工具。

这篇文章 (Science Bulletin, 2023, 68: 1752–1756) 开发了一种名为硫结合特异性测序技术(SBS-seq)，分析了来自不同物种的三种典型SBD的高分辨率全序列特异性，包括来自革兰氏阴性肠道菌群Morganella morganii的SBD_Mmo，来自革兰氏阳性腐生土壤菌株Streptomyces pristinaespiralis的SBD_Spr，以及最近从海洋菌株Hahella ganghwensis中发现的SBD_Hga。然后，作者采用FP测定和EMSA验证了SBS-seq测定了的序列特异性，三个SBD的序列标识显示特异性定义在PT修饰周围-1 ~ + 3nt的核心区域(图1a，上图)。体外选择后的富集情况 (图1a，中图和下图），说明SBD在这4-bp区域具有序列特异性。通过SBS-seq研究SBD在3-PT和5-PT修饰的DNA底物上的全序列特异性（图1b和c），SBD_Mmo和SBD_Spr核心序列的最大R值和最小R值分别下降了60% (图1b，下图) 和70% (图1c，下图)，显示出比1-PT文库更宽松的序列特异性。

图1 SBD结合序列：通过SBS-Seq在1-PT (a)、3-PT (b)和5-PT (c)底物上鉴定的特异性（来源于原文Figure 1）

总的来说，SBD和PT-DNA的亲和力强、范围广，串联PT修饰增强了结合亲和力，与非特异性序列结合的显著改善证明了串联修饰的序列范围扩展效应等优势为建立新的核酸检测平台提供了便利。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.scib.2023.07.012

DNAzymes在信号检测的生物传感器中起着至关重要的作用，但诊断应用需要特定的结构，使其设计复杂化。硫原子可以通过各种方式并入核酸，包括2-硫代脱氧胸腺嘧啶、4-硫代脱氧胸腺嘧啶、6-硫代-2’-脱氧鸟苷和硫代二硫酸磷等。这篇文章 (Chemical Engineering Journal, 2024, 493: 152548) 报告了一种通过磷硫酸(PS)键 (图1a) ，将硫原子结合到DNAzymes的新方法。与传统的依赖于g-四联体等特定结构的DNAzymes不同，这种方法可以在没有结构限制的情况下产生高酶活性，证实了酶活性可以通过修改DNA主干来控制 (图1b) 。

图1 将硫掺入核酸（来源于原文Figure 1）

这篇文章还研究了PS修饰的数量、DNA的长度和各种核碱基组合对酶活性的影响。研究发现，随着PS键数的增加，酶的活性也随之增加(图2a)。在20个连续的A、T、C、G核苷酸序列(A20、T20、C20和G20)中，A20和G20序列的吸收增加，而C20和T20序列的吸收变化不显著。值得注意的是，与其他核苷酸不同，G20的酶活性在有PS和没有PS的情况下都有所增加(图2b)。对于C20和T20，酶活性并没有随着PS键数的增加而增加(图2c)。

图2 (a) PS数量对随机序列的影响；(b)单个PS键对相同序列长度的连续核苷酸(A20, T20, C20和G20)的影响；(c) PS键数目对相同序列长度的连续核苷酸 (A20, T20, C20) 中酶活性的影响（来源于原文Figure 2）

该文章还提出了经PS修饰的DNAzyme催化氧化ABTS可能的机理（图3），DNAzyme-H₂O₂-hemin复合物中的相互作用加速了决定速率的质子转移步骤 (化合物0→化合物0*)。

图3 PS修饰DNAzymes催化ABTS氧化的机理（来源于原文Figure 3）

为了验证该机制，测量不同数目PS键对A10酶活性的影响(图4)。酶活性随着PS修饰数量增加而增加，特别是从4到8个PS键(图4a和b)。根据静电电位(ESP)图，氧原子被硫原子取代导致颜色从红色(相对负电荷)变为黄色(相对正电荷) (图4c)。随着PS修饰的数量从0增加到8，N1和N7原子的电子密度增加，特别是在PS键附近的腺嘌呤碱基和PS键连续时(即A4-A7位)(图4d)。因此，为了使PS修饰通过加速决速步质子转移来影响酶的活性，腺嘌呤中的N1和N7的电子密度应比PO-DNA增加，且电子密度较高的碱基应位于PS附近。

图4 根据A10中PS修饰的数量评估酶活性并进行相应的计算分析（来源于原文Figure 4）

由于胸腺嘧啶在四种核碱基(A、T、C和G)中对碱基-H₂O₂-hemin复合物-碱基相互作用的贡献最小，因此将其作为主链评估PS附近核碱基组合的酶活性。实验结果证实，酶活性随 PS 附近碱基组合的不同而变化（图 5b），碱基提高酶活性的优先级依次为A、G、C和T。为了更清楚展示酶活性的差异，选择GC含量为50%，不形成二级结构的随机DNA序列(T2-DNA)，引入了两个PS键。结果表明，碱基组合实验结果可作为酶活性调控中PS位点选择的有效指导(图5d、e)。

图5 PS附近核碱基组合对酶活性的影响（来源于原文Figure 6）

总之，这篇文章开发了一种新的PS DNAzyme方法，利用PS键修饰将硫原子引入核酸并随后提高酶活性，还提出了酶活性增加的基本原理。PS修饰后核碱基电子密度的变化增强了腺嘌呤(N1) -H₂O₂-hemin复合物-腺嘌呤(N7)的相互作用，加速了决速步，从而提高了酶活性。这篇文章用密度泛函理论计算验证了这一现象，并验证了在指定序列内最佳PS定位，以提高酶活性。与依赖特定结构(如g-四联体)的传统DNAzymes不同，该方法作为潜在的酶促信号系统具有显著的多功能性，且无需预先确定的序列或结构即可有效运行。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.152548

CRISPR技术革新了基因组操作和基因治疗。尽管HDR能实现精确基因敲入，但其效率较低，尤其是针对大型DNA供体。短单链DNA（ssDNA）供体因其高效性和低毒性而备受关注，而长单链DNA（lssDNA）在基因组编辑中显示出巨大潜力，但生产挑战限制了其应用。酶法合成lssDNA虽有所发展，但仍存在耗时、成本高及纯化复杂等问题。此外，最新研究显示ssDNA在HDR中的优势可能并不明显，需进一步优化HDR供体以提高CRISPR/Cas9介导的基因敲入效果。由于PT修饰易于商业合成且成本低廉，已被广泛用于5’端或3’端DNA 链的装饰，以保护 DNA 末端在体外或体内不被外切酶降解。

在这篇文章中（PNAS, 2023），作者利用单个供体中ssDNA和dsDNA的独特优势，通过长dsDNA与3’-悬垂介导的CRISPR敲入(Long dsDNA with 3’-Overhangs mediated CRISPR Knock-in, LOCK)（图1A、B），来进行CRISPR-Cas9引导的大片段敲入 (KI) ，该供体在两端具有最佳的10-nt 3’悬垂，称为悬垂dsDNA (odsDNA)。

图1用于基因大小KI的odsDNA供体的设计依据（来源于原文Figure 1）

本研究通过硫代磷酸酯（PT）修饰的PCR引物制备了具有不同长度3’悬垂的双链DNA（odsDNA）（图2C）。该方法有效防止了λ外切核酸酶的过度消化（图2B），实现了在PCR扩增的dsDNA中产生稳定的3’端悬垂。在多种哺乳动物细胞系中(图2E-G)，与Cas9 RNPs共转染的odsDNA供体显示出较高的敲入效率，特别是10 nt悬垂的odsDNA供体在四个目标基因组位点上的平均敲入效率比dsDNA供体提高了3.1倍(图2D)。

图2 大片段KI模板中最佳3′悬垂长度odsDNA供体的制备与测定（来源于原文Figure 2）

另外，本研究比较了不同DNA供体在基因编辑中的效率与准确性。结果显示，带有10 nt悬垂的odsDNA在5’和3’连接处的Indel率低于dsDNA，且与悬垂长度无关(图3A)。扩增子测序分析表明，odsDNA和ssDNA供体的精确HDR敲入率是dsDNA的2.5倍(图3B，右图)。GIS-seq分析揭示odsDNA供体具有较低的脱靶编辑活性，与dsDNA相当(图3E)。

图3 odsDNA供体的KI表现出更高的HDR频率和低脱靶整合（来源于原文Figure 3）

通过设计特定的PCV2连接子来增强对单链寡核苷酸供体（odsDNA）的靶向结合与切割效率(图4A)，评估了优化的Cas9-PCV2融合蛋白在介导大片段基因敲入（KI）中的效能。使用10-nt悬垂的odsDNA供体相较于双链DNA（dsDNA）显著提高了KI效率，其中Cas9-PCV2/10-nt odsDNA组合表现最佳，分别实现了45%（1,010 bp）和31%（2,500 bp）的KI率 (图4C、4D)。此外，这一优化策略还降低了indel（插入/缺失）事件的发生率，表明其在提高精确基因编辑效率方面的优势。

图4 Cas9-PCV2共价拴住odsDNA供体以增强KI （来源于原文Figure 4）

此外，本研究探索了通过人工延长的sgRNA（esgRNA）与odsDNA供体之间的碱基配对来提高基因编辑效率的策略。共电穿孔实验表明，esgRNA/Cas9 RNPs能够有效捆绑odsDNA供体并在细胞核内共定位(图5B)。在HEK293T细胞中，esgRNA/Cas9 RNP-tethered odsDNA供体的共电穿孔显著提高了大片段敲入（KI）率，达到38%，是dsDNA供体的四倍，并且降低了indel编辑(图5C)。进一步优化esgRNA序列，发现间隔区域的长度对KI率无显著影响。

总的来说，与现有方法相比，LOCK可以高效地将千碱基大小的DNA片段靶向插入哺乳动物基因组，成本低，脱靶效应低，敲入频率比传统的基于同源重组的方法高5倍以上。这种基于同源定向修复的新设计的LOCK方法是一种强大的工具，适用于基因工程、基因治疗和合成生物学迫切需要的基因大小片段整合。

原文链接：https://doi.org/10.1073/pnas.2221127120