背景
脂质纳米颗粒（LNP）在核酸递送方面取得了巨大的进展，为核酸药物的应用做出了重大贡献。但是我们在制备LNP的过程中时常会发现一些颗粒与颗粒之间的异质性，在冷冻电镜（cryo-TEM）和X射线小脚散射（SAXS）等纳米表征技术下，颗粒之间的纳米结构上往往存在一些差异，这在研究中往往容易被忽视。在脂质-核酸复合体的形成过程中一直有一些问题没有得到回答：脂质纳米颗粒的内部拓扑是怎样的？由哪些因素决定？对功能又有何影响？
在LNP的合成中，有多种脂质分子参与其中：阳离子/可电离脂质，辅助脂质，PEG-脂质。这些脂质往往都是具有两亲性的分子，有亲水的头部和疏水的尾部组成。在一个经典的LNP形成模型中，这些疏水的带正电的头部会主动结合带有负电的核酸形成LNP的内核，最终被PEG-脂包围稳定，形成球形的颗粒（图1）。
图 1 RNA负载的LNP的形成机制
但是两亲性分子的组装系统是一个高度灵敏的复杂系统，受到分子本身性质，组装环境等条件的影响，分子并不总是像我们预想的那样形成组装。两亲分子受到自身包装系数P以及其他因素的影响，可能会形成其他多种复杂的拓扑结构，如：球形，圆柱体胶束，层状结构，反相六方相等其他拓扑结构（图2）。
图 2 两亲性分子的多种组装状况收到包装系数P的影响
近来，一些研究者仔细研究了这种结构上的差异的来源，并发现这些拓扑结构上的不同对核酸的转染效率，尤其在溶酶体逃逸能力方面有潜在的影响。
01
脂质纳米颗粒拓扑调节膜融合
从而影响内体逃逸
文章研究了脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNP）的拓扑结构对内涵体逃逸和RNA递送效率的影响。研究者发现，通过调控LNP内部结构（例如逆六方相和双连续立方相），可以降低LNP与内涵体膜融合所需的能量，从而显著提高LNP从内涵体逃逸的效率。
研究者认为，不同的纳米拓扑结构可以影响内体膜融合过程，而膜的弹性高斯模量和高斯曲率会受到不同拓扑结构的影响从而影响膜融合过程中的弹性能量消耗。目前已知的LNP中的纳米拓扑主要有：层状的L相，反相六方相的HⅡ相和双连续立方相QⅡ，这些不同的拓扑构象具有不同的存储核酸的形式以及膜融合能（图 3）。
图 3 不同拓扑结构的LNP膜融合参数存在差异
研究参考已有的设计合成了不同纳米拓扑结构的LNP（例如层状、立方相和反相六方相），通过冷冻电镜（cryo-EM），X射线小脚散射和电子衍射的方法确定了这些特殊的纳米拓扑的形成并表征其特点（图4）。
图 4 不同拓扑结构的LNP的表征
研究者比较其与内涵体膜的融合效率。结果显示，相较于层状结构，立方相和反六方相结构的LNP更易与内涵体膜融合，从而提高了逃逸效率。同样的，通过细胞内荧光追踪和FRET实验，研究者发现立方相LNP能够降低内涵体膜融合所需的能量，增加RNA释放到细胞质中的成功率。这种结构在内涵体逃逸方面表现显著优于传统的层状结构LNP。研究者还尝试使用不同脂质成分（如GMO、DOTAP等）以稳定LNP的立方相结构，并添加胆固醇以进一步增强LNP的融合性。结果显示，含有特定脂质组合的立方相LNP表现出最佳的RNA递送和基因敲低效果。
这一篇文献从膜融合的角度研究了LNP不同的拓扑结构对其功能的影响，立方相的LNP相比起传统的层状LNP有显著更好的膜融合性能，促进了内体逃逸过程，由此可以介导更高效的核酸递送。该工作揭示了拓扑结构相关的膜融合性能对LNP内体逃逸以及核酸递送的影响，给了我们一个新的角度去优化改进现有的LNP递送体系。
原文链接: https://doi.org/10.1073/pnas.2301067120
02
反相液晶相脂质促进LNP的转染效率
该文献的研究主要工作是探讨如何通过液晶反相脂质相（如反六角相）来增强小干扰RNA（siRNA）的脂质纳米颗粒（LNP）递送效率。通过比较含有不同脂质相结构的LNP，研究者发现反六角相结构较层状结构更有助于提高LNP的细胞内沉默效率。
研究者首先通过增加负曲率（R0 < 0）的脂质DOPE的含量得到了反相六方相含量更高的LNP。通过增加DOPE逐渐取代成分中的胆固醇，液晶相的含量逐渐提高。这表明通过合理的设计，可以控制产生的LNP的拓扑结构（图5）。
图 5 通过合理的成分设计调节LNP的拓扑构象
正如先前的研究一样，研究者发现反相液晶相的LNP拥有更高的siRNA递送效率。研究者详细研究了这些LNP与单层囊泡（LUV）结合的过程，并以此模拟LNP和溶酶体膜融合的过程。Cryo-TEM和SAXS数据表明，层状的LNP在和LUV共孵育后会产生层状到反相六方相的相转变，而六方相的LNP则没用这种转变并且表现出更高的融和效率。研究者据此提出一种可能的机制，在膜融合过程中，层状拓扑的LNP需要先转变为反相六方相再进行核酸的递送，而本身预先形成的液晶相LNP则可以一步进行核酸的递送因而获得了更高的递送效率（图6）。
图 6 不同拓扑结构的LNP和囊泡结合的过程
这一研究对不同拓扑结构LNP的递送机制进行了很好的补充，特别对于拓扑结构对溶酶体逃逸的影响提出了很好的解释。
原文链接: https://doi.org/10.1038/s41467-024-45666-5
03
pH介导的LNP拓扑相变与mRNA转染
还有一些研究发现，LNP拓扑在环境变化时会进行动态变构，这种变化和环境pH有直接的关系。当环境pH从中性逐渐变化到酸性时，LNP的层状的拓扑会逐渐变化为其他形式，这种酸碱度的变化和内吞后内体成熟过程的酸碱度变化范围是一致的。这种一致性暗示了在LNP摄入到从内体释放的过程中，其内部拓扑很可能经历了一系列变构，可能影响到其释放机制，对其释放效率有潜在影响（图7）。
图 7 LNP在内体里经历拓扑变构
图 8 多种脂质形成的LNP都会发生pH响应型的动态拓扑变构
并且这种拓扑的变化容易受到多种条件的影响，比如使用的脂质的类型，以及引入的核酸都会影响其结构与变化（图8）。但无论变化如何，多方面研究都表明，更容易产生立方相的LNP往往能够具有更高的转染效率，立方相的形成被认为能够有效破坏内涵体或溶酶体膜，促进mRNA的释放。
这些研究又进一步的研究了LNP在经历细胞内化过程的具体机制，揭示了拓扑结构及其变化和LNP内体逃逸有着密切的关联。
原文链接: 1）https://doi.org/10.1073/pnas.2310491120
2）https://doi.org/10.1021/jacs.3c08729
总结
参考文献
(1) Pattipeiluhu, R.; Zeng, Y.; Hendrix, M. M. R. M.; Voets, I. K.; Kros, A.; Sharp, T. H. Liquid Crystalline Inverted Lipid Phases Encapsulating siRNA Enhance Lipid Nanoparticle Mediated Transfection. Nat Commun 2024, 15 (1), 1303. https://doi.org/10.1038/s41467-024-45666-5.
(2) Philipp, J.; Dabkowska, A.; Reiser, A.; Frank, K.; Krzysztoń, R.; Brummer, C.; Nickel, B.; Blanchet, C. E.; Sudarsan, A.; Ibrahim, M.; Johansson, S.; Skantze, P.; Skantze, U.; Östman, S.; Johansson, M.; Henderson, N.; Elvevold, K.; Smedsrød, B.; Schwierz, N.; Lindfors, L.; Rädler, J. O. pH-Dependent Structural Transitions in Cationic Ionizable Lipid Mesophases Are Critical for Lipid Nanoparticle Function. Proceedings of the National Academy of Sciences 2023, 120 (50), e2310491120. https://doi.org/10.1073/pnas.2310491120.
(3) Yu, H.; Iscaro, J.; Dyett, B.; Zhang, Y.; Seibt, S.; Martinez, N.; White, J.; Drummond, C. J.; Bozinovski, S.; Zhai, J. Inverse Cubic and Hexagonal Mesophase Evolution within Ionizable Lipid Nanoparticles Correlates with mRNA Transfection in Macrophages. J. Am. Chem. Soc. 2023, 145 (45), 24765–24774. https://doi.org/10.1021/jacs.3c08729.
(4) Zheng, L.; Bandara, S. R.; Tan, Z.; Leal, C. Lipid Nanoparticle Topology Regulates Endosomal Escape and Delivery of RNA to the Cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2023, 120 (27), e2301067120. https://doi.org/10.1073/pnas.2301067120.
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往期回顾
JACS | 缺氧对LNP介导的mRNA递送影响的疗效和机制驱动研究
Science Advances | mRNA-LNP的结构和生化特征决定抗SARS-COV-2的体液和细胞免疫反应
M3R Lab
作者｜zst
审核｜sj
排版｜xjc
