青委专刊 | 浅低温和深低温对大鼠体外循环后脑神经炎症和冷休克反应的影响

浅低温和深低温对大鼠体外循环后脑神经炎症和冷休克反应的影响

靶向温度管理（targeted temperature management，TTM）是体外循环（CPB）治疗过程中的一种神经保护策略，可能的机制是激活冷休克蛋白。本文旨在研究浅低温与深低温对大鼠CPB后神经炎症反应和冷休克相关蛋白表达的影响。

Wistar大鼠分为CPB组及假手术组进行1h浅低温（33℃）或深低温（18℃）。分别于术后第1d（短期组）、第3d或第7d（长期组）进行PET扫描，分析18kd转运体蛋白（TSPO）的放射配体11C-PBR28，以评估神经炎症反应。短期组和长期组分别取大脑海马和皮质样本，分析M1和M2小胶质细胞相关细胞因子的mRNA表达。检测冷休克蛋白RNA结合基序蛋白3（cold shock protein RNA-binding motive 3, RBM3）和酪氨酸受体激酶B（tyrosine receptor kinase B, TrkB）的表达并定量。

两组大鼠均在实验开始1h内达到目标温度。CPB组大鼠11C-PBR28在第1d和第3d的标准摄取值（standard uptake values, SUV）与假手术组大鼠相似。第7d，深低温（18℃）CPB组的杏仁核和海马区SUV显著高于浅低温（33℃）CPB组。TTM 18℃和33℃之间M1和M2小胶质细胞相关细胞因子的表达水平无差异。第1d和第7d，33℃CPB组皮质和海马中RBM3蛋白水平显著高于18℃CPB组和sham 33℃组。

与TTM33℃相比，TTM18℃增加了杏仁核和海马的神经炎症反应。此外，与TTM18℃相比，TTM33℃诱导CPB大鼠皮质和海马中TrkB和RBM3的表达增加。因此，TTM33℃很可能是通过诱导冷休克蛋白的激活发挥保护作用，从而减轻神经炎症程度。

神经认知功能障碍是心脏手术后常见并发症，心脏手术后3个月其发生率约为8%-27 %。尽管体外循环（CPB）、外科手术和麻醉技术都有较大进步，但在越来越多的老年心脏手术患者中，神经损伤仍然是面临的较大问题。许多病理生理机制参与神经认知障碍的发生和发展，这些机制包括血脑屏障破坏、脑灌注不足、脑血管自动调节功能受损、脑微栓以及全身炎症和中枢神经系统炎症等。中枢神经系统炎症最主要通过激活小胶质细胞来调控。

小胶质细胞被认为是脑内的巨噬细胞，其在突触活动、功能可塑性和神经形成中发挥重要作用。根据刺激的不同，小胶质细胞的促炎表型称为M1样小胶质细胞，而抗炎表型，称为M2样小胶质细胞。M1样小胶质细胞表达IL-1β、TNF-α、IL-6和NOS2等细胞因子，促进神经炎症、氧化应激和神经退行性变。相反，M2样小胶质细胞通过表达TGF-β、IL-4和IL-10等细胞因子，调节轴突再生、突触可塑性和血管生成来促进组织修复，发挥抗炎作用。

治疗性低温是一种用于减轻心脏手术期间和之后神经损伤的策略。低温治疗的神经保护作用与几种机制有关，包括温度依赖性的代谢降低，导致氧需求的降低，同时通过降低多巴胺和谷氨酸等兴奋性神经递质的细胞外水平来降低中枢神经系统的过度兴奋。低温还可减少自由基形成和抑制细胞凋亡。虽然低温诱导的整体蛋白合成下降，但低温可以诱导冷休克蛋白RNA结合基序蛋白（RBM3）的表达。RBM3的表达受到酪氨酸受体激酶B（TrkB）信号通路的调控，表达水平升高时，RBM3可以防止突触和神经元的减少。此外，RBM3在细胞应激情况下对转录后mRNA调控和蛋白质合成具有重要调节作用。虽然治疗性低温可能对神经损伤有保护作用，但低温也可能产生不良反应，如凝血功能障碍和感染风险增加等。

虽然低温的神经保护作用众所周知，但只有少数研究比较了不同温度对CPB后神经炎症反应的影响。此外，还没有证据表明低温治疗的深度与CPB中的神经炎症和冷休克蛋白的表达有关。因此，本研究的目的是研究浅低温（33℃）和深低温（18℃）对CPB术后神经炎症的影响，通过小胶质细胞的激活和冷休克蛋白的表达来研究神经炎症反应。

成年雄性Wistar 大鼠（n = 39），体重>450 g。随机分组如图1。所有大鼠都被单独安置，并保持每12h的光照和黑夜循环周期，自由获得食物和水。

图1：实验分组

使用5%异氟醚进行麻醉诱导，并通过鼻持续给予2-3%异氟醚O2/空气（1：1）吸入。麻醉后进行气管插管和机械通气，呼吸频率80次/min。尾静脉插管给予阿托品（40µg/kg）、罗库溴铵（0.5mg/kg）及芬太尼（40µg/kg）静脉麻醉。直肠探头连续监测温度，左股动脉插管进行血压监测，CPB期间平均动脉压维持在60-100mmHg之间。持续静脉输注氯胺酮（70mg/ml）维持麻醉，输注速度为1.2~1.5ml/h。

所有大鼠按照标准方案降温，使用冰垫、CPB回路降温或在假手术大鼠腹部冰敷降温。

CPB方案根据大鼠模型进行修改，选用不需要额外输血的超小型回路，并可以通过CPB回路进行变温。CPB插管前，给予3000IU/kg肝素。22号针套管插入左颈动脉作为动脉供血管路，4.5FR静脉插管通过右颈静脉插入右心房作为静脉血引流管路。

手术过程中连续监测脉率和血氧饱和度。分别在降温15 min后（体温30~33℃）、冷却55 min后（体温=33℃或18℃）和停机拔除动脉套管时（体温35℃）采集血样。气体流量800ml/min，O2:空气为1:4。目标CPB流速为100~120ml/kg.min。开始CPB后，CPB33℃组的氯胺酮输注速率降至初始输注速率的40~50%，CPB18℃组降至初始输注速率的10~20%。

CPB1h后开始复温。复温的速度为每5 min 2℃。假手术组使用加热垫及暖风复温。术后高热预防措施是从35℃开始，只用加热垫保温，CPB回路和暖风复温停止。脱离CPB并断开回路后给予单剂量鱼精蛋白1500IU/kg静脉注射。拔出插管缝合伤口后停止麻醉，待大鼠恢复意识后拔除气管插管。丁丙诺啡（10µg/kg）作为术后镇痛药给予一次。实验结束后大鼠放置在温暖的笼子中恢复至少4h。所有实验均在上午8点-下午12点半之间进行。

为了评估神经炎症反应，研究组使用TSPO配体11C-PBR28进行了PET扫描，这是一种检测小胶质细胞活化的示踪剂。短期组在CPB手术前、手术后第1d进行PET扫描，长期组在第3d和第7d进行PET扫描。

39只大鼠其中29只完成了手术和PET扫描（图1）。

尽管深低温假手术组仅依赖于外部降温，但能够与CPB大鼠组相似的速度降温（见图2）。CPB组达到33℃平均10（8~16）min，假手术组平均7（6~7）min。CPB组达到18℃平均48（45~49）min，假手术组为平均54（52~56）min。所有处理组在复温前的最后一次温度相似。在CPB停止时，核心温度保持在37.5℃以下。

图2 CPB组和假手术组大鼠的核心体温记录。

CPB组和假大鼠组在术后第1、3d、7d的11C-PBR28的轴向PET图像如图3所示，CPB组温度18℃出现左前半球（海马前部）高示踪剂摄取。

图3：术后第1d、3d和7d，大鼠11C-PBR28的代表性轴向PET图像（脑周长用白色虚线表示，箭头指出了PBR28激活的区域。）

分别于第1d和第7d分析皮质和海马中的TrkB受体和RBM3蛋白水平（图4）。

图4：第1d和7d时CPB组和假手术组大鼠冷休克蛋白的蛋白分析

本研究目的是研究浅低温和深低温对CPB大鼠术后神经炎症反应和冷休克蛋白表达的影响。研究发现，与33℃相比，18℃第7d海马和杏仁核中小胶质细胞的激活更多。在CPB短期组和长期组中，M1和M2小胶质细胞相关细胞因子的mRNA表达没有差异。尽管CPB被视为一个刺激，但CPB33℃组的大鼠在任何时间点都未发现神经炎症的迹象。此外，研究发现在CPB33℃组的大鼠的组织中可以诱发TrkB受体和RBM3表达，而在CPB18℃组中没有发现。该研究数据表明，33℃的CPB辅助手术可能比18℃在神经保护方面具有优势，这与皮质和海马中冷休克蛋白的表达增加有关。

除了全身性炎症外，脑微栓塞、脑灌注不足和脑缺血-再灌注损伤被认为是导致CPB患者中枢神经损伤的主要原因。在接受CPB辅助主动脉弓重建的新生儿中，术中需经历约为30 min深度低温停循环，在脑循环中立即可观察到炎症反应。此外，在一项对绵羊的研究中，在亚低温下CPB 3h结束时的细胞形态学分析直接证明了小胶质细胞的激活。之前的假设是深低温这个单独因素可能导致神经损伤，但在该研究中深低温和浅低温都没有增加假手术组动物11C-PBR28的摄取。

当比较CPB18℃和CPB33℃之间的神经炎症反应时，结果发现与浅低温相比，深低温与海马和杏仁核小胶质细胞的激活存在较高的相关性。这与该研究发现的深低温与神经炎症反应增加相一致，有越来越多的证据表明深低温对神经系统有害。深低温心脏骤停和CPB后的永久性神经功能障碍和脑组织病理学损伤已被证实。

本研究在浅低温下接受CPB的大鼠在任何时间点都没有发现神经炎症的迹象。浅低温和深低温对小胶质细胞激活的影响尚未在CPB模型中进行研究。其他条件下的研究，包括短暂缺血，表明浅低温对小胶质细胞的激活有抑制作用。在短暂整体缺血大鼠模型中，与正常体温相比，TTM33℃和36℃相比显著抑制了M1激活。在同一项研究中，低温并没有促进小胶质细胞向有益的M2表型的激活，这表明TTM并不诱导小胶质细胞向抗炎表型M2的激活，而是阻断了小胶质细胞M1的激活。虽然该研究没有发现M1和M2小胶质细胞相关细胞因子的表达存在差异，但浅低温组中未出现神经炎症，证实了浅低温抑制小胶质细胞激活的假说。总的来说，浅低温在防止小胶质细胞激活方面优于深度低温。

冷休克蛋白RBM3被认为在低温诱导的神经保护中发挥了关键作用。高温下调RBM3，将温度从37℃小幅降低到32-34℃，也足以诱导RBM3的表达。在小鼠海马切片培养中，与正常体温相比，33℃上调了RBM3蛋白的调控。相比之下，深低温并没有显著上调RBM3。该研究在第7d大鼠海马和皮质中，33℃的CPB组比18℃组的RBM3蛋白水平更高。此外，该研究通过研究RBM3调控因子TrkB的表达与RBM3的表达相关来支持该研究结果。

总之，与TTM33℃的大鼠相比，TTM18℃的大鼠杏仁核和海马的神经炎症反应较明显。此外，与TTM18℃相比，TTM33℃能够诱导CPB大鼠皮质和海马中TrkB和RBM3的表达增加。综上所述，TTM33℃可能通过冷休克蛋白诱导招募保护机制、从而减轻神经炎症。因此，浅低温可能是改善CPB心脏手术患者术后认知功能的潜在策略。