青委专刊 | 体外循环血泵剪切应力导致红细胞膜氧化的研究

体外循环血泵剪切应力导致红细胞膜氧化的研究

剪切应力引起的红细胞损伤与红细胞的生理衰老在机械脆性增加、红细胞聚集增加和膜表面电荷减少方面存在一些相似之处。本研究假设体外循环血泵产生剪切应力是通过加速红细胞膜氧化的机制从而致其衰老，并对此进行了研究。从屠宰场采集新鲜猪血，并用柠檬酸钠抗凝。体外测试回路包括BP-80血泵，设置泵速2000rpm，泵压为100-120mmHg。循环约500ml抗凝全血180分钟，在循环开始时和循环后180分钟采集血样。对血样的溶血水平和红细胞膜氧化量进行分析和比较。研究发现溶血随着泵回路内剪切暴露时间的延长而增加。循环泵血180min后，红细胞膜氧化水平增加0.1nmol/mg蛋白。此外，剪切红细胞的膜氧化水平高于对照红细胞。这些结果表明，血泵循环加速了红细胞的衰老，这使我们更好地了解了血泵灌注对红细胞的影响。

关键词：剪切应力，溶血，LVAD，膜氧化，红细胞

红细胞的主要作用是利用细胞内血红蛋白（Hb）将氧气输送到器官和外周组织。红细胞具有独特的变形能力，能够通过毛细血管将氧气输送到组织中。红细胞在骨髓中产生并释放到血液循环中，其寿命为100-120天，在此期间，它们在各种生理剪切应力下变形为可弯曲的形状，并在气体交换过程中多次暴露于氧化应力。衰老的红细胞会表现出变形能力下降和密度增加，因此，衰老红细胞会被困在脾脏中，在那里它们被巨噬细胞所吞噬。

超生理的剪切应力会导致红细胞损伤累积，从而导致红细胞的破坏、变形能力受损及密度增加。这种机械应力也会发生在机械循环支持（MCS）装置的内部组件中，包括血泵、经皮植入装置和体外膜肺。此外，超生理剪切应力会导致并发症，如溶血导致的氧气运输受损。

另一方面，红细胞细胞膜由脂质双分子层组成，含有覆盖内部Hb的不饱和脂肪酸。一旦红细胞持续暴露于高浓度的氧气中，其脂质膜上未饱和的脂肪酸会被活性氧（ROS）转化为一级产物脂质过氧化物和二级产物丙二醛。此外，红细胞中Hb的自氧化会产生ROS，如过氧化氢（H2O2）和超氧化物（O2−）。H2O2会诱导spectrin和Hb之间形成共价复合物，从而增加红细胞膜的刚性并降低其变形能力。

考虑到上述因素，一些研究人员报告了衰老即氧化应激红细胞和被剪切应力损伤的红细胞的一些相似之处，包括密度升高、表面电荷损失和聚集性增加。在此背景下，我们假设泵循环中产生的机械剪切应力会促进红细胞膜的氧化。因此，本研究的目的是检查体外血泵循环是否导致红细胞膜氧化，并了解这种机械辅助循环装置的生物学效应。

在屠宰场采集猪全血，并将其与3.24wt%柠檬酸钠以1:10混合。将抗凝全血储存在0℃–10℃温度范围内，并在采血后1天（n=6）转运至实验室。

血泵循环管路模拟了MCS相关机械应力对红细胞的影响。该循环管路包括一个BP-80血泵（美敦力）、一个储血袋、一个夹子和内径为9.5毫米、长度为2米的聚氯乙烯管。选择BP-80血泵的原因在于它不仅在临床常规使用，还用于评估新开发血泵抗溶血的性能。管道包含用于测定泵前和泵后压力以及血液取样的端口（图1）。540mL猪血作为预充液预充整个闭式循环回路并进行循环。循环参数：泵速为2000 rpm，泵压为100-120mm Hg，BP-80泵流量为5L/min。流速的选择参考了ASTM F1841-97，因其介绍了将红细胞持续暴露在血泵机械应力下抗溶血性能的方法。测试血样在循环开始后和180分钟后抽取。180分钟的持续时间为ASTM F1841-97的一半，目的在于在所有细胞破裂之前检查红细胞的可变形性和红细胞的脂质过氧化物水平。将每个样品以1500×g离心10分钟，并对血浆层进行溶血测量。去除血浆后剩余的红细胞用磷酸盐缓冲盐水以1500×g洗涤两次，持续10分钟。因为衰老的红细胞具有更高的密度，且变形性下降，并且含有与衰老程度相对应的更多的脂质过氧化物。所以，上层和下层各1mL离心后的红细胞悬浮液被单独收集，并在洗涤程序后分别定义为年轻红细胞和衰老红细胞。

使用Harboe测定法测定血浆游离血红蛋白（pfHb）值。用1485µL 0.1%碳酸钠将15µL血浆稀释100倍。然后使用分光光度计在380、415和450nm处进行吸光度测定。使用以下公式评估pfHb的量：

A415、A450和A380表示每个波长的吸光度，而Vtotal（µL）和Vplasma（µL）分别表示测量样品的总体积和血浆体积。

在本研究部署了一个定制的反向旋转剪切发生器。该系统包括一个剪切室和一个倒置显微镜（图2a）。剪切室通过使内部和外部圆柱体反向旋转而产生剪切应力。通过40×物镜在倒置显微镜上获得剪切应力下红细胞的形态变化（图2b）。简言之，将1490µL 10%聚乙烯基吡咯烷酮加入10µL年轻或衰老细胞中进行150倍稀释。将用于评估变形能力的剪切应力调节至30Pa并加载60s。使用配备有100fps的记录速度和512×512像素高速摄像机获得的图像并提取红细胞形态。通过使用Image J测量红细胞长轴和短轴来计算伸长率指数（图3）。

我们测量过测定过氧化脂质产物的量，来评估红细胞膜的氧化水平。丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）反应形成硫代巴比妥酸的活性物质（TBARS），其最大吸收波长约为532nm。因此使用分光光度计测量532nm处的吸光度。

将从泵回路收集的红细胞与10µL丁基羟基甲苯（BHT）、1%磷酸和0.7%TBA试剂混合。然后使用加热器将混合物在100°C下孵育60分钟。随后，将样品冷却至室温，并添加2000µL 1-丁醇以提取TBARS。在3000rpm离心10分钟后，用氢氧化钠提取丁醇部分，并加入磷酸以去除Hb并中和样品。为了量化每1mg蛋白质中的丙二醛，使用Bio-Rad蛋白质测定法测定蛋白质。

使用F检验对每个数据集进行正态性检验。当方差被认为相等时，使用多重比较的t检验。所有数据均采用JMP Pro 14版进行分析。数据报告为平均值±标准差（SD），p＜0.05被认为具有统计学意义。

pfHb的量从泵循环前的<50mg/dL显著增加到泵循环180分钟后的>200mg/dL（p<0.01，图4）。

年轻红细胞的伸长指数从泵循环前的0.56显著降低到泵循环180分钟后的0.51（p<0.05，图5）。衰老红细胞的伸长指数在泵循环前为0.51，在180min后为0.47，无显著性差异。

在年轻红细细胞中，脂质过氧化物的量从泵循环前的5.98 nmol/mg蛋白质增加到泵循环180分钟后的7.66 nmol/mg（图6）。对于衰老红细胞，脂质过氧化物的量在循环前为9.10nmol/mg，在180min后为9.33nmol/mg。尽管在泵循环后观察到细胞膜氧化总体增加，但差异并不显著。

在本研究对血泵循环后第一个和180分钟内的pfHb水平、红细胞变形能力和脂质过氧化物水平进行了定量分析。我们的结果显示pfHb水平升高，变形能力降低，脂质过氧化物水平升高。

许多研究人员已经评估了pfHb水平，以评估红细胞对机械应力的反应。当血泵内部的剪切应力超过150Pa时，就会出现溶血。在本项研究中，180分钟的泵循环使pfHb水平增加到200mg/dL以上。此前，Naito等人对使用各种血泵后的溶血水平进行了检查，BP-80血泵证实pfHb的量增加，约为9.0mg/dL。本研究中pfHb的较高水平高于Naito等人，这可以通过泵转速的差异来解释。

红细胞的变形能力随着暴露于超生理剪切应力的时间延长而降低。我们发现在泵循环180分钟后，年轻红细胞的伸长指数从0.56显著降低到0.51。相反，对于衰老红细胞，没有发现伸长指数的显著降低。其原因是红细胞抗剪应力的耐久性有限。换言之，离心后从试管底层提取的红细胞已经是大部分红细胞中变形最小的红细胞。因此，变形性进一步降低的红细胞有可能被泵回路中产生的剪切应力破坏。

泵循环180分钟后，年轻细胞的脂质过氧化物水平略有增加。作为连续脂质过氧化反应的起点，氧合血红蛋白的自氧化解释了泵循环和红细胞膜氧化的关系。多步化学反应式如下所示：

血液中存在的氧合血红蛋白发生自动氧化反应，会产生ROS，如过氧化氢（H2O2）和超氧化物（O2−），氧气和过氧化氢产生了哈伯韦斯反应。

这些反应解释了泵循环180分钟后红细胞出现的变化。泵循环中产生的高剪切应力会伤害红细胞并导致溶血。血红蛋白自氧化在红细胞膜中产生的ROS可以与产生脂质过氧化物的蛋白质反应，从而修饰膜蛋白，影响细胞膜脂质层和膜结构，上述理论支持了本研究的结果。因此，本研究结论是，细胞膜的氧化水平是由于泵循环过程中产生的血浆游离血红蛋白水平的增加而上升的，而不是剪切力本身所导致的。

这项研究的一个局限性是过氧化脂质量变化的测量误差很大。大误差的原因可能与TBA的测定方法有关，可能包括人为误差。在未来的工作中，用一种时间依赖性较小的高精度测量方法测量脂质过氧化物将更好地阐明可能发生的溶血机制。此外，我们的实验是在室温下进行的，没有模拟临床条件。然而，这项研究成功地提供了新的知识，即红细胞膜氧化水平会在暴露于血泵回路后增加。这有助于阐明红细胞在MCS下的损伤及衰老机制。

在本研究中，我们使用泵回路将血液暴露于剪切应力下，并测量了泵循环前后溶血、红细胞变形能力和脂质过氧化物水平的变化。泵循环180min后，红细胞溶血率升高，红细胞变形能力下降，过氧化脂质含量略有增加。这种现象被认为是由于剪切应力诱导的溶血引起的氧合血红蛋白的自动氧化，从而增加了脂质过氧化物的量，从而降低了红细胞的变形能力。

图1：使血液暴露于机械应力的体外循环管路。

图2：剪切应力下红细胞形态的可视化系统的照片(a)和示意图(b)。

图3：剪切应力下，伸长红细胞的代表性图像（在180 min的泵回路中循环后的年轻细胞）和伸长指数的测量公式

图4：在泵循环180 min后，用分光光度法测定的血浆游离血红蛋白（pfHb）水平。结果报告为：平均值±SD，n=6，*p<0.01。

图5：用剪切可视化系统的显微镜测量泵循环180 min后的年轻和衰老红细胞的伸长指数。结果报告为：平均值±SD，n=6，*p<0.05。

图6：在泵循环180 min后，年轻和衰老的红细胞的脂质过氧化物水平。结果报告为：平均值±SD，n=6。