人诱导多能干细胞衍生的心脏球体使非人灵长类动物心肌再生研究
翻译:宝玉 昆明市延安医院
审校:杨晓芳 首都医科大学附属北京安贞医院
摘要
背景
人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(CMs)可通过心外膜协同下的工程化心脏组织移植技术应用于受损心脏的临床治疗,而将CMs直接植入心肌层的可行性尚不清楚。尽管报道称直接植入法可诱导电信号将CMs电整合到心肌细胞中,但仍存在CMs植入不良和移植后心律失常的风险。因此,在这项研究中,我们制备纯化的人类诱导多能干细胞衍生的心脏球体(hiPSC-CSs),并研究通过直接注射是否能使心肌梗死的非人灵长类动物心肌细胞再生。
方法
我们通过两项独立实验来探索人类诱导多能干细胞来源CMs的合适数量。第一项实验中, 在移植前2周对10只食蟹猴建立心肌梗死模型,随机分为含有2×107 CMs的hiPSC-CSs的受体组和对照组(生理盐水)。实验期间监测心功能和心律失常,移植12周后施行安乐死,并完成心脏组织学分析。在第二项实验中,使用含有更多CMs(6×107)的hiPSC-CSs重复上述相同移植研究过程。
结果
在两组实验中,含有2×107 CMs的hiPSC-CSs受体显示出移植CM有限的分化能力和短暂的短轴缩短率升高(移植后第4周短轴缩短率:受体组vs 对照组 26.2±2.1% vs 19.3±1.8%;P<0.05),但移植后心律失常发生率低。增加CMs剂量后,可显著提高移植物分化程度和长期的心肌收缩获益(移植后12周短轴缩短率: 受体组vs 对照组22.5%±1.0% vs 16.6±1.1% P<0.01;左心室射血分数:受体组vs 对照组49.0±1.4% vs 36.3±2.9%;P<0.01)。相较而言,含6×107 CMs的hiPSC-CSs受体移植后心律失常的发生率略有增加。
结论
本研究证明直接注射hiPSC-CSs可以恢复灵长类动物心梗后心脏的收缩功能,且接受治疗后的心律失常发生风险在可接受范围内。虽然其机制尚未完全阐明,但上述研究结果能为使用等效CM产品进行临床试验提供了强有力的证据。
关键词:心脏球体(CS);心肌细胞(CM);食蟹猴;人诱导多能干细胞(hiPSC);心肌梗死;移植后心律失常
临床观点
研究新发现?
·人诱导多能干细胞衍生心脏球体移植在灵长类动物心肌梗死模型中具有可行性。
·移植的人类诱导多能干细胞衍生心脏球体能长期存活,提高心肌收缩力,移植后室性心律失常的发生率相对较低。
临床意义是什么?
·人诱导多能干细胞衍生心脏球体的移植技术可适用于需远距离运输的机构,使患者获益。
·鉴于其简单的制备过程和功能的有效性,人诱导多能干细胞衍生心脏球体可能作为最佳形式的心肌细胞产品应用于心脏再生治疗中。
前言
心脏疾病急性发作时通常会导致大量心肌细胞(CMs)受损,在此过程中,受损CMs被非收缩性纤维组织所取代,最终可导致慢性心力衰竭。从理论来看,利用人类诱导多能干细胞(hiPSC)来源的CMs (hiPSC-CMs)再生心肌策略目前具有很大吸引力,hiPSC-CMs生成和代谢等相关性研究使CMs在临床中应用成为可能。此外,在动物模型的验证研究中,多能干细胞来源的CMs (PSC-CMs)已被证明移植后能够长期存活,可与宿主CMs电整合,并恢复受损心脏的收缩功能。在已有动物研究结果的基础上,多个机构已开展了将含有hiPSC-CMs移植到心外膜的临床研究。本团队也正在启动一项名为LAPiS的临床试验,用于探索hiPSC-CMs直接移植到心肌层的可行性。然而,有几个问题需要解决。首先,心脏再生治疗所需的CMs数量仍然未知,特别是可应用于临床治疗的CM产品。目前已经测试了几种改善CM移植策略,包括与基质胶共同移植[6,17]和对PSC-CMs基因修饰以增强细胞增殖,虽然这些技术是有效的,但在临床应用上仍然受到许多限制。多数移植的CMs会在血液循环过程中被带走,即使它们保留在心肌层中,移植的CMs也会因细胞外基质和邻近细胞的附着丧失而发生凋亡,这一现象称为失巢凋亡。我们的研究小组生成了代谢纯化的hiPSC衍生的心脏球体(hiPSC-CSs),这些球体有望有效保留并预防失巢凋亡。
心肌细胞移植后与移植物相关的心律失常是另一个更为普遍关注的问题。由于成年心肌细胞和PSC-CMs之间的电特性存在显著差异,即使采用最先进的成熟方案,只要移植物CMs与宿主CMs整合,移植物相关心律失常就不可避免。因此,了解移植物相关性心律失常的严重程度,对其进行适当的预防治疗显得尤为重要。
在本研究中,我们生成了含有适量CMs的hiPSC-CS产品,并将其移植到食蟹猴心梗模型体内,不仅因为其与人类心梗模型接近,同时还适合评估移植CM增值分化和移植物相关心律失常,本研究将通过上述研究观察移植物、生理及电生理结果。
研究方法
详细实验方法见附件材料(包括Tables S1–S9,Figures S1–S7 References 42–50)或与研究者取得联系
研究结果
hiPSC-CMs的制备
HLA(人类白细胞抗原)单倍型纯合子hiPSCs (FfI14s04)由京都大学提供。将hiPSCs分化为CMs,并使用去葡萄糖和谷氨酰胺的乳酸培养液进行代谢纯化。所有的细胞培养过程,包括hiPSCs的维持、扩增和心肌细胞分化,都在无动物来源成分和明确可控的化学成分培养基中进行。结合对hiPSC-CMs生物学特性评估检测(图1),我们制备了相对成熟和几乎纯净的室性CMs。将制备完成后的hiPSC-CMs冻存后用于后续细胞移植研究。
图示实验结果:
1)通过检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达水平对CMs的纯化程度进行评估:纯化前(图1A)和纯化后(图1B)显示纯化后阳性CMs(99.4±0.1%;n=7)可产生多达99.8%的cTnT。
2)通过膜片钳技术记录到的CMs的自发性搏动频率为每分钟34±13次,表现为室性动作电位模式,如图1C和1D所示。最大舒张期电位为-58.4±0.64 mV,90%动作电位复极时程为465±25ms(图1D)。
3)CMs对β受体激动剂异丙肾上腺素、钾通道阻滞剂胺碘酮和HCN4阻滞剂伊伐布雷定反应呈剂量依赖性(图1E-1F)。
4)免疫细胞化学检测显示大多数CMs为α-辅肌动蛋白表达阳性和波形蛋白表达阴性(图1G)。
5)通过肌球蛋白轻链(MLC)评价hiPSCs向CMs的分化效率和成熟度,图1H和1K显示尽管有84.6%成熟CMs表现为MLC2V+/MLC2A-,7%为MLC2V-/MLC2A+,其余为未成熟CMs或心室亚型心肌细胞,但它们都可表达大量的细胞间隙连接蛋白43和N-钙粘附素(图1I和1J)。
图1:hiPSC-CMs生物学特性
在非人灵长类动物受损心肌中植入hiPSC-CSs
我们在先前预实验中采用相同细胞系及细胞培养程序,观察到单个心脏球体(CS) 大小约为145±2μm(n=50),其内平均含有960±150单位CMs (n=4)。为了证实hiPSC-CSs的存活能力,我们培养了来自两个不同hiPSC谱系的CS。培养4周后,经细胞活性标记物检测表明hiPSC-CSs内部的CMs可以直接利用细胞外培养液存活。此外,hiPSC-CSs即使在培养12周后仍能保持其分化纯度(图S1)。此外,还利用免疫缺陷小鼠模型证实了hiPSC-CSs在健康的心脏中能够有效存活(图S2A至S2C)。
本实验共采用10只食蟹猴(Macaca fascicularis),雄性4只,雌性6只,随机分成为两组,雌雄比例相等(表S2)。所有动物在细胞移植前2周建立心肌缺血损伤模型,即阻断左冠状动脉前降支中段180min后再灌注。通过心电图一过性ST段抬高及血清cTnT水平升高(图S3A)确认已造成心肌缺血损伤。免疫抑制方案为每天注射甲基强的松龙、环孢素(图S4)和每两周注射一次阿贝西普。实验组动物注射含有hiPSC-CSs(含量为2×107 CMs)的生理盐水,对照组仅注射生理盐水。移植后12周实验动物被安乐死,并收集心脏样本。通过天狼星红染色法测定瘢痕面积在两组间无差异性(占左心室总面积:对照组vs受体组9.12±1.74% vs 5.24±0.49%; P = 0.15;表S3)。
图示实验结果:
将冷冻保存的hiPSC-CMs运送至实验室,细胞解冻并复制到6孔板上以生成hiPSC-CSs(图2A和2B)。hiPSC-CMs在6孔板中培养7天后,于移植当天在生理盐水中收集分化生成的hiPSC-CSs备用。
台盼蓝染色法测定解冻即刻及4小时后hiPSC-CMs细胞存活率为95.8±2.2%(图2C)。
在4例hiPSC-CS受体猴中的使用人心肌肌钙蛋白I (hsTnI)鉴定移植CMs (图2D至2H、2J和2K):移植CMs(绿色),cTnT鉴定宿主和整合的CMs(红色)。
移植物区域CMs与宿主区域CMs呈现相似的条纹(图2G和2H),两者cTnT表达含量和CM直径相同(图2I),表明移植后12周移植物CMs在接近宿主CMs的水平上成熟,同时经CD45测定没有移植CMs排异迹象(图2L)。
图2 含量为2×107 CMs 的hiPSC-CSs移植后受体心脏组织学分析
hiPSC-CSs移植后短轴缩短率短暂增高,没有或很少发生心律失常
超声心动图(图3A;表S4)和血清BNP水平(图S3B)表明移植前对照组和受体组的心功能障碍相似。移植后4周,CS受体组与对照组及自身移植前相比较心肌收缩功能均有显著改善;然而,在移植后12周,两组间的短轴缩短率不再具有统计学意义(图3A;图S5A)。移植前、移植第4、7、14天及移植后每隔一周记录动态心电图:对照组中没有观察到明显的室性心律失常(图3C和3E),1例hiPSC-CSs受体在移植后2周出现了短暂性室性心动过速(图3B、3D和3F)。其余4例hiPSC-CSs受体在整个实验期间很少或没有室性心律失常(图3D和3F)。短轴缩短率(FS%)移植前vs移植后:##P<0.01,受体组vs对照组:*P<0.05。
图3 含量为2×107 CMs 的hiPSC-CSs移植后受体心脏机械和电生理分析
hiPSC-CSs的大量植入和大量的CM移植
我们推测2×107 CMs的hiPSC-CSs含有移植细胞数目较少可能是移植后心律失常发生率较低的原因。因此,我们决定在下一组移植研究中增加CMs的数量。为此,我们另外制备10只食蟹猴,随机分为对照组和含有6×107 CMs的hiPSC-CSs组(表S5)。最初,我们验证了hiPSC-CSs是否可以在4°C的条件下从细胞生产设施地运输到距离较远的动物实验所,从而使该疗法更具临床可行性。这两个设施相距230公里(图S6A),运输时间为221±22分钟,在此期间,hiPSC-CSs在4°C下保存(图S6B),观察到hiPSC-CSs中CMs的存活率令人满意(图2C)。受体心脏缺血损伤模型及免疫抑制剂给药方式同前,含有6×107 CMs的hiPSC-CSs移植组中有1只动物在心肌受损后立即死亡,对照组(n=5)和含有6×107 CMs的hiPSC-CSs移植组(n=4),移植12周后进行组织学分析。
图示实验结果:
两组间瘢痕面积无差异(表S6;图4O),与含有2×107 CMs的受体相比,hiPSC-CSs受体的移植物面积相对于疤痕面积和左心室分别增加了13倍和27倍(图4A至4C和4P、4Q):hsTnI(绿色),对移植CMs进行鉴定,2×107 CMs受体组 vs 6×107 CMs受体组:###P<0.001和P<0.05。
食蟹猴安乐死后组织学显示肺、肝、肾或脾未见异位CMs植入迹象(图S7),CMs主要位于缺血心肌疤痕区、边缘区和心肌细胞正常区(图4A;表S6)。大部分可表达cTnI,但仍有少部分表达骨骼肌慢肌肌钙蛋白(ssTnI),如图4D和4E所示,表明移植物CMs没有完全成熟。此外,所有CMs均可表达cTnT,大多数为MLC2V+的成熟心室亚型,小部分CMs表达MLC2A+(图4F和4G):移植区域的ssTnI(红色)、hsTnI(绿色)、移植区MLC2A(红色)、MLC2V(绿色)免疫染色。
移植后12周后,移植区还可见少量Ki-67阳性细胞和cTnT阴性非室性心肌细胞,(图4H):移植物区域的Ki-67(绿色)、cTnT(红色)免疫染色。
CMs表达大量细胞间隙连接蛋白43和N-钙粘附素(图4I、图4J、图4L和图4M),血管分化情况良好(图4K和图4N)。这些发现表明移植的hiPSC-CSs在接近宿主CMS的成熟水平下存活:N-钙粘附素(品红色)、MLC2V(绿色)免疫染色,间隙连接蛋白43(品红色)、 cTnT(绿色)免疫染色。用番茄凝集素(品红色)鉴定移植物和宿主组织之间边界区的内皮细胞。
图4 含量为6×107 CMs 的hiPSC-CSs移植后受体心脏组织学分析
6×107 CMs的hiPSC-CSs移植后较低的心律失常发生率以及心肌收缩功能的长期益处
图示实验结果:
我们通过计算机断层扫描和超声心动图来评估心脏收缩功能(图5A):移植前以及移植后4周和12周具有代表性计算机断层扫描图像。
超声心动图显示,hiPSC-CSs的受体组比对照组表现出更高的短轴缩短率,并且这种益处持续到移植后12周(图5C;图S5B;表S7):移植前以及移植后4周和12周短轴缩短率(FS%)。
同样在移植后4周和12周,使用计算机断层扫描评估的hiPSC-CSs受体组的左心室射血分数(LVEF%)明显高于对照组(图5B;图S5C;表S8)。此外,我们先前对健康食蟹猴(n=5)进行了计算机断层扫描分析,总体平均射血分数64.6±1.5%,对比表明移植的CMs部分恢复了心脏射血功能:计算机断层扫描评估的左心室LVEF移植后vs移植前**P<0.01和***P<0.001。移植后组间#P<0.05和##P<0.01。
2例含6×107CMs的hiPSC-CSs受体移植后表现出持续性室性心动过速,然而,第14天后未再观察到心律失常(图5D至5G)。即使在室性心动过速发生率最高的动物(编号C100)中,室性心动过速总持续时间最长的也仅占一天的3.2%,最高心率为每分钟176次(表S9)。
图5 含量为6×107 CMs 的hiPSC-CSs移植后受体心脏机械和电生理分析
讨论
PSC-CMs技术在受损心肌修复治疗中的应用
研究表明PSC-CMs在治疗受损心肌方面具有很大的潜力。在动物模型中使用PSC-CMs进行心脏修复有几种不同的技术路线。其中之一是将PSC-CMs移植到心外膜中,这种方法可以避免使用传统注射方法相关的风险,例如组织损伤、出血、血栓形成和心肌水肿。但该方法的潜在限制是移植的心脏组织与宿主心脏组织之间的电整合可能有限。另一种方法是直接将PSC-CMs注射到心肌层,在动物模型中直接注射的一个重大技术挑战是难以确保移植细胞在精确的预定位置存活。事实上,我们在猿猴受体的心肌缺血瘢痕区、边缘区和正常心肌区域都能观察到移植CMs,甚至在小鼠受体的右心室也观察到移植CMs。未来的研究需要更加深入地探索如何优化移植细胞的存活率和功能整合,以及如何选择最佳的移植区域和方法来最大化修复效果。这些研究将为心脏病的治疗提供更有效的策略。
移植的CMs已被证明可与邻近的内源性CMs同步收缩,被称之为心肌细胞再生治疗。在心肌细胞再生治疗中使用药物鸡尾酒治疗(特定系列药物和生物因子的组合)可以促进CMs分化、增殖、提高移植成功率和功能整合,但当CMs与药物鸡尾酒一起移植时同时也带来了使用化学上未明确的动物衍生产品相关的风险和担忧。工程化的心肌细胞(CSs)是一种被设计用于心脏修复的生物工程产品,它们通常由CMs在特定的培养环境中形成的细胞聚集体组成。这些细胞聚集体能够模拟心肌组织的结构和功能,提供一个三维的支架即人类诱导多能干细胞衍生心脏球体(hiPSC-CS),有助于细胞间的相互作用和整体功能的提升。工程化的CSs作为治疗受损心脏组织的CMs产品有几个优点:首先,容易生产制备;其次,hiPSC-CS在4°C的生理盐水溶液中保持其活性至少4小时,且不需要进行特殊细胞处理,可以实现在不同的医疗机构间的运输和使用;最后,正如本研究结果,hiPSC-CS可以提供足够的CMs移植面积,移植后12周仍有显著的收缩恢复。此外,通过Ki-67阳性率测定表明,心肌收缩功能的恢复不仅是由于移植CMs分化的直接作用,还可能涉及旁分泌效应,如刺激内源性CMs增殖和促进新血管形成。
含CMs的hiPSC-CS移植后相关心律失常
提高输入的细胞数量可能增加CMs移植面积从而获得更好的治疗效果,但这也增加了注射所致的心肌损伤和心律失常风险。通过每周或每两周的动态心电图监测,我们观察到CMs含量较大的受体移植后心律失常的发生率较高,尽管监测的间隔可能导致我们低估了所有受体的实际发生率。在本研究中观察到移植后心律失常所表现出的特征与先前研究观察结果相似:非快速性、非致命性和一过性表现。然而,与以前的研究结果相比,本研究中心律失常的持续时间要短得多,发生率也较低。移植后心律失常发生率高低包括以下几个原因:同种或异种CMs移植细胞来源,抗心律失常药物的应用以及CMs的纯度及成熟度。本研究实验动物采用了人源性CMs,但联合使用了免疫抑制剂控制排异反应,同时移植的CMs对抗心律失常药物具有反应性,即抗心律失常药物可以减少移植后心律失常发生的频率,其次本研究中移植了纯度超过99%的CMs,这是其他研究中记录的最高水平的CM纯度。与这些发现相一致的是,CMs在蛋白质表达水平和电生理特征上表现出相对成熟的表型。在本研究中hiPSC-CS受体移植后的心律失常是可控的,因此,在与本研究相同的情况下,重复验证抗心律失常药物是否可以确实降低CMs相关心律失常的发生率具有较大的临床应用价值。
开展进一步临床LAPiS研究
在当前研究中取得这些有利结果后,我们启动了临床LAPiS研究。在这项研究中,我们将移植等效的hiPSC-CSs,而在研究设计方面有几个不同之处。首先,LAPiS研究中hiPSC-CSs含移植CMs数量定为 5×107 CMs;其二,受体为接受冠状动脉旁路移植手术的缺血性心肌病患者;第三,这项临床研究将使用一种专门为人类心脏设计的带有6个圆顶针头的注射装置;最后,如前所述这项研究为同种异体细胞移植。虽然食蟹猴的主要组织相容性复合体的基本结构与人类白细胞抗原(HLA)相同,但在免疫系统方面有很大的不同。因此,在LAPiS研究中,我们选择了人类CMs移植的不同免疫抑制剂方案:甲基强的松龙、他克莫司和霉酚酸酯。我们将密切监测实验,以确保临床研究结果能提供该治疗是否具有效性的证据。
结论
总而言之,本研究将 hiPSC-CS移植到灵长类动物心肌梗塞模型中,观察到了移植CMs可长期存活且心脏收缩力得以改善,以及移植后心律失常发生较短暂且为非致命性。此外,我们还确定了临床心肌细胞再生所需的适当移植CM 数量指标。因此,这些结果足以为我们开展临床试验提供充分的可行性依据。
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