青委专刊 | 搏动血流增加 METTL14 诱导的 m6A 修饰并减轻脓毒性心肌病：一项实验研究

搏动血流增加 METTL14 诱导的 m6A 修饰并减轻脓毒性心肌病：一项实验研究

脓毒症心肌病是脓毒血症引起的心血管并发症，其伴有严重的微循环灌注不良。有新的证据提示搏动血流在微循环障碍情况下的保护作用，但其潜在机制仍不清楚。本研究的目的是探讨 N6-甲基腺苷（m6A）修饰，在缓解搏动血流体外膜肺氧合（ECMO）支持的脓毒症心肌病中的作用机制。

建立脓毒症心肌病大鼠模型，分别给予搏动或非搏动血流ECMO支持。使用超声检查测量外周灌注指数（PPI）和心功能参数。采用斑点印迹法检测m6A水平，并采用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光和免疫组化检测相关基因的表达。进行RNA免疫沉淀验证分子之间的相互作用。

ECMO 产生的搏动血流可显著提高脓毒症心肌病大鼠模型的微循环PPI，改善心肌功能，保护内皮细胞并延长生存期。搏动血流介导METTL14（甲基化转移酶）表达增加，而METTL14又进一步介导m6A 对密闭小带蛋白1(ZO-1) mRNA 的修饰，这种修饰可稳定ZO-1 mRNA，但这取决于YTHDF2（甲基化阅读蛋白）的存在。搏动血流抑制 PI3K-Akt 信号通路，该通路的下游分子 Foxo1（METTL14 的负转录因子）与 METTL14 启动子结合，抑制 METTL14 诱导的 m6A 修饰。

ECMO产生的搏动血流增加了METTL14诱导的ZO-1中的m6A修饰，并延缓了脓毒症心肌病的进展，这表明搏动血流可能通过减轻微循环障碍而成为脓毒症心肌病的一种新的治疗策略。

关键词：脓毒症心肌病; pulsatile flow; 体外膜氧合; 微循环; N6-甲基腺苷

脓毒症心肌病是一种脓毒血症引起的以心室功能障碍为特征的严重心血管并发症，临床预后不佳。脓毒症心肌病的病理生理改变较为复杂,包括微循环障碍、心肌收缩力受损、炎症级联反应以及心肌代谢紊乱等。脓毒症心肌病的治疗选择有限，这也提示我们开展新的治疗方法的重要性。微循环是复苏的主要决定因素和理想终点，微循环灌注不良与脓毒血症死亡率和发病率增加相关。脓毒症心肌病表现为微循环灌注不良，会导致内皮功能障碍和凝血系统激活，免疫反应增强，最终导致器官损伤、微循环衰竭和死亡。因此，避免微循环不良的策略可能有益于脓毒症心肌病患者。

越来越多的证据强调了体外循环、体外膜肺氧合 (ECMO) 和心源性休克期间，当微循环受到干扰时，搏动血流起到的积极作用。搏动血流通过提供能量等效压力和剩余血流动力学能量来增强微循环灌注，同时在生物学角度减轻促炎细胞因子的产生。既往研究表明，搏动血流上调ZO-1的表达并可以保护内皮完整性。

搏动血流应用于脓毒症心肌病的相关研究很少。Kim等学者利用身体振动研究了搏动血流对脓毒症小鼠影响，搏动血流减少了IL-1β和TNF-α的产生。类似的，有研究表明：身体周期性加速引起的搏动血流保留了一氧化氮合酶（ eNOS ）水平并可以减少促炎细胞因子产生。值得注意的是，理论上搏动血流可能是针对 COVID-19 的治疗辅助手段。然而，上述运动引起的搏动血流的中断和不稳定性限制了其未来在脓毒症心肌病中应用的潜力。最近的一些研究表明，在动物模型中，ECMO 提供的搏动血流稳定且成功地支持微循环，并抑制内皮激活。在此背景下，有必要探讨搏动血流对脓毒症心肌病是否具有治疗作用。

N6-甲基腺苷 (m6A) 是 mRNA 和非编码 RNA 中最常见的修饰之一，它调节 RNA 剪接、翻译和稳定性。最近有研究报道m6A修饰参与多种病理生理过程，包括炎症和脓毒血症。Shen等人揭示了lncRNA-XR_343955中METTL3的下调和m6A水平的降低会激活炎症反应并干扰脓毒血症期间的内皮完整性和功能。Zhang等人发现，YTHDF1（一种已知的 m6A阅读蛋白）脓毒性休克小鼠模型中可促进 NLRP3 泛素化，并抑制炎症。搏动血流是否影响 mRNA 的 m6A 修饰及其潜在机制仍不清楚。

在本研究中，我们使用了动物模型和心脏微血管内皮细胞(CMVEC) 来模拟脓毒症心肌病，由 ECMO和生物反应器提供搏动血流。 m6A 修饰在此病理生理过程中的作用得到了深入的研究。本实验研究的目的是评估搏动血流是否能减轻脓毒症心肌病并探究其可能的机制。

购买SD大鼠（10周龄，约200g）并在SPF条件下饲养。实验方案经本机构动物管理委员会批准，符合ARRIVE指南。按照文献中的方法，用 20mg/kg 的大肠杆菌脂多糖（Sigma）创建脓毒症心肌病大鼠模型。然后通过超声心动图监测，直到左心室射血分数（LVEF）降低至基线水平的30%。

将16只脓毒症心肌病大鼠模型随机分为两组：非搏动组和搏动组。分别使用尾动脉和尾静脉建立动脉、静脉通路。大鼠用1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔诱导麻醉，吸入5.0%异氟醚混合空气，用16G导管经口气管插管，导管连接Reward R407动物呼吸机，容量控制通气（频率：70 bpm，潮气量 10 mL/kg）。用22G导管（Terumo）对右颈总动脉进行插管，并作为ECMO动脉灌注管。然后将18G 静脉插管（Togo-medkit）通过右颈内静脉插入，送至右心房并用作 ECMO的静脉引流管。 ECMO 管路用 8 mL 林格氏溶液和 500 IU 肝素预充。该管路由带有流量阻尼器的蠕动泵（PreFluid）驱动，如前所述，提供搏动或非搏动灌注，实验使用动物膜式氧合器和ECMO管路（西京医疗器械）。ECMO运转6个小时。

我们使用外周血流灌注指数（PPI）来测量脓毒症心肌病动物的组织灌注。 PPI是光通过脉搏血氧仪时微循环搏动的血流与非搏动静态血流比值。使用激光多普勒灌注监测仪（PeriFlux System 5000）评估 PPI 。参数是在 32 Hz 频率下获得的，并通过分析软件（PeriSoft for Windows）进行测量。超声心动图由一位经验丰富的实验员操作，实验员对分组情况不知情。使用超声机（GE）在 M 模式下测量 LVEF 和左室短轴缩短率 (FS)。参数测量三次并取平均值。

将实验动物的心脏组织固定在10%缓冲福尔马林中，石蜡包埋、切片，用苏木精和伊红（HE）进行染色。对于免疫组织化学 (IHC) 分析，提取心脏组织并用 4% 多聚甲醛固定，同时孵育针对以下抗体的一抗：ZO-1（Signalway Antibody）和 METTL14（Abcam）。使用 Zeiss Axio Observer检测图像。Masson染色按照Masson三色染色试剂盒（Absin Bioscience）的方案进行。

从安乐死的 SD大鼠的左心室中分离出大鼠心脏微血管内皮细胞 (CMEC)。简而言之，将切片的左心室在 PBS 中洗涤并在 0.1% 胰蛋白酶（Procell）中消化。将细胞以 300 × g 离心 10 分钟，并在含有 10% 胎牛血清（Gibco）的CMEC 培养基（Procell）中室温孵育。每 3 天更换一次细胞培养基。

如前所述，我们使用Flexcell装置为 CMEC产生搏动。将接种在Flexcell板上的 CMEC（1 × 105细胞/孔）用平流（0 dyne/cm2）或搏动血流（3 dyne/cm2）处理 6 小时，频率和流速分别为 1 Hz 和 2 mL/min。

在实验设置中，CMEC 暴露于搏动或非搏动血流条件下。使用TRIzol试剂（Invitrogen）分离 CMEC 的总 RNA。使用磁珠mRNA分离试剂盒（New England Biolabs）的方案收集 Poly (A)+ mRNA。使用特异性m6A抗体（Synaptic Systems），通过斑点印迹分析检测Hybond N+ 膜上点样的 mRNA 。

在pGL3 基础载体（Promega）上构建了 METTL14 启动子区域（序列-2000 bp 至 100 bp），并在其中建立了报告质粒。为了构建 Foxo1 的 shRNA，合成了 Foxo1 mRNA 的寡核苷酸，并克隆到 pLKO.1-puro 载体（Qiyunbio）中。将大鼠 METTL14 (NM_001399249.1) 和 Foxo1 (NM_001191846.3) 的全长 OFR 分别克隆到 pcDNA3.1 (+) 载体 (Qiyunbio) 和 pcDNA3.1 (+)/ myc -His C 载体中（LMAI Bio.Corp）。为了去磷酸化Foxo1，构建了Foxo1基因S250A和S313A点突变质粒： pcDNA3.1(+)/myc-Foxo1(S250A)和pcDNA3.1(+)/myc-Foxo1(S313A)，并通过DNA测序验证。4000×g离心半小时，将重悬的慢病毒用于靶细胞转染，然后给予细胞嘌呤霉素（索拉生物）5天。

TRIzol试剂提取总RNA后，使用Superscript III逆转录酶（Invitrogen）进行逆转录。 PCR 样本由互补 DNA、power-SYBR Green Mix（Applied Biosystems）和特异性引物组成。使用LightCycler 480PCR仪，每个实验进行三次qRT -PCR。表达水平以GADPH作为内参进行了标准化。

myc His C载体（LMAI Bio.Corp）对照或pcDNA3.1（+）/ myc His C-Foxo1质粒转染CMEC ，然后共转染报告质粒，包括pGL3-basic-METTL14启动子载体和TK- Krenilla载体。转染1天后，根据双荧光素酶报告系统（Promega）的方案进行荧光素酶报告基因测定。将萤火虫荧光素酶活性归一化为Renilla信号的活性，计算转染效率。荧光素酶报告基因测定的数据独立测量三次。

使用 EZ-Magna RIP 试剂盒（Merck Millipore）完成 RIP。将细胞在 RIP 裂解缓冲液中裂解，然后在4℃ 下以 12000 × g 离心 30 分钟。将上清液与 METTL14 或 YTHDF2 (Abcam) 抗体或蛋白 A/G 结合物磁珠上的 IgG 抗体(对照) (MedChemExpress) 4℃孵育过夜。用结合的RNA的磁珠进行免疫沉淀。将磁珠用RIP缓冲液洗涤四次，然后用10％SDS、蛋白酶K(MedChemExpress)和RIP缓冲液在55℃处理半小时。输入组或 IP的 RNA 用 TRIzol 试剂回收，并进行 qRT-PCR。

RIPA 裂解缓冲液（MedChemExpress）进行蛋白质提取。将总蛋白进行10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，将其浸入5%脱脂牛奶中。随后将膜用指定的一抗在 4℃ 下处理过夜。随后将二抗在室温下孵育1小时。最后用ECL试剂进行蛋白质检测（Amersham Life Science）。使用 Image J 软件对印迹进行定量分析。所有实验均进行三次。

对于组织免疫荧光，心脏组织切片用抗 CD31（三友生物）和抗 ZO-1（Signalway Antibody）在 4℃ 过夜处理，然后添加二抗(Abcam)，然后进行 4',6-二脒基2-苯基吲哚 (DAPI) (Abcam) 染色。对于细胞免疫荧光，CMEC 在室温下用 4% 多聚甲醛固定 30 分钟，然后在含有 3% 牛血清白蛋白的0.2% Triton X-100（MedChemExpress）中孵育 1 小时。将样品与针对 ZO-1 和 CD31 的一抗，在室温下孵育过夜。最后将载玻片与二抗和 DAPI 一起孵育。使用荧光显微镜（奥林巴斯）获得免疫荧光图像并拍照。

用对照载体或 pcDNA3.1 (+)/ myc His C-Foxo1 载体转染 CMEC 48 小时后，使用ChIP试剂盒（Beyotime）进行ChIP测定。 CMEC用PBS洗涤并添加甲醛培养30分钟。添加甘氨酸后，洗涤 CMEC，并在 4℃ 300 × g 下离心。然后将细胞重悬于 1mL 超声缓冲液中。4℃、15000×g离心15分钟后，收集上清液，其中10％作为输入，90％用抗MYC标签抗体（Huabio）处理，4℃过夜。添加 Protein A/G 磁珠后，用 PCR 纯化试剂盒（Qiagen）提取免疫沉淀的 DNA，并通过qRT -PCR 检查。

暴露于搏动或非搏动血流的 CMEC 用 10 μg /mL 放线菌素 D（MedChemExpress）处理以抑制 RNA 形成。如上所述，在不同时间点收获 CMEC 并提取总 RNA。通过qRT -PCR测量 ZO-1 mRNA 的剩余水平，并将其标准化为治疗前的水平。

使用 Prism 8.0进行统计分析。如果正态分布，连续变量显示为平均值±标准差，否则应用中位数和四分位数范围。组间比较通过学生 t 检验或曼-惠特尼 U 检验进行。为了比较不同时间点mRNA稳定性的组间差异，应用重复测量方差分析。所有假设检验都是双向的，所有低于 0.05 的 p 值均被视为具有统计显着性。

为了研究搏动的作用，我们用搏动或非搏动ECMO 治疗脓毒症心肌病大鼠。我们使用蠕动泵来产生搏动血流（图 1A），所有动物的ECMO均运转顺利，没有出现插管失败、治疗终止或循环衰竭的情况。病理分析显示，与非搏动组相比，搏动组心脏组织炎症浸润较少，心肌损伤减轻。 Masson 染色进一步显示，在非搏动组中观察到受损的胶原蛋白，但在搏动组中未观察到受损的胶原蛋白（图 1B）。通过测量心肌酶，我们发现非搏动组的 CK-MB 和 LDH 水平显着较高（图 1C），而搏动组大鼠的心肌酶较低。为了检查脓毒症心肌病大鼠的外周组织灌注和心功能，进行了超声检查。我们的数据显示，搏动组大鼠的 PPI 显着高于非搏动组（图 1D），这表明搏动血流增强了严重感染性休克时的外周组织灌注。同时，在 ECMO 支持过程中，与非搏动组大鼠相比，搏动组大鼠的 LVEF 水平和平均 FS 显着更高（图 1E）。此外，搏动血流还与脓毒症心肌病大鼠较长的总生存时间相关（图1F）。

图1 搏动血流ECMO可减轻脓毒症心肌病大鼠的心肌炎症并提高存活率

(A)脓毒症心肌病大鼠ECMO的建立。(B)脓毒症心肌病大鼠 ECMO 支持后心脏切片的代表性图像， HE（左）和 Masson（右）染色。标尺条代表 50 μm.。(C)两组大鼠血清 CK-MB 和 LDH 水平（n=8），**P<0.01。(D)6 小时内搏动或非搏动血流 ECMO 支持大鼠的外周灌注指数（PPI），*p<0.05，**p<0.01。(E）ECMO 支持期间不同时间点大鼠 LVEF（%）和 FS（%）的比较，*p<0.05。(F)搏动或非搏动血流ECMO支持大鼠的存活率分析。

缩写：NP-ECMO，非搏动血流ECMO；P-ECMO，搏动血流ECMO；PPI，外周灌注指数；LVEF，左心室射血分数；FS，短轴缩短率。

为了确定搏动血流是否维能持脓毒症心肌病大鼠的内皮结构，测量了内皮结构的重要标志物 ZO-1的表达。经ECMO支持后，搏动组心脏组织中ZO-1的表达明显高于非搏动组（图2A）。IHC 分析中也呈现了类似的结果，提示搏动血流引起 ZO-1 的表达增加（图 2B）。有趣的是，心脏组织免疫荧光结果显示，搏动血流ECMO支持增加了微循环毛细血管的密度，这似乎与ZO-1表达呈正相关（图2C）。此外，我们推断搏动血流会影响CMEC。在体外，CMEC 暴露于非搏动或搏动血流。免疫荧光显示，与搏动血流相比，非搏动血流处理的 CMEC 

图2 搏动血流维持ZO-1的表达

(A)脓毒症心肌病大鼠在搏动或非搏动ECMO支持下 ZO-1 的相对表达（n=8）。(B)通过免疫组化检测ECMO支持后脓毒症心肌病大鼠心脏组织中的ZO-1蛋白。标尺条代表 50μm。(C) 用免疫荧光法对心脏组织进行ZO-1（绿色）、CD31（红色）和 DAPI（蓝色）染色，结果显示 ECMO 产生的搏动性血流增加了微血管密度和 ZO-1 的表达。标尺条代表 50μm。(D)免疫荧光对 CMECs 的 ZO-1（绿色）染色表明，搏动血流下 ZO-1表达上调。(E)qRT-PCR 分析 CMECs 中的 ZO-1 mRNA，*p<0.05。(F)通过WB检测 CMECs 中 ZO-1 蛋白的表达。

缩写：NP-ECMO，非搏动血流ECMO；P-ECMO，搏动血流ECMO；DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚；CMEC，心脏微血管内皮细胞。

斑点印迹分析表明，与非脉动血流处理的 CMEC 细胞相比，搏动血流处理的 CMEC 中的整体 m6A 修饰明显更高（图 3A 和 B）。然后，我们筛选了在流动模式（非脉动流或脉动流）上的m6A修饰过程中已知的的m6A reader（m6A 结合蛋白）、writer（甲基转移酶）和 eraser（脱甲基酶）的表达。蛋白质印迹和 qPCR 分析显示，搏动模式处理的 CMEC中 METTL14 和 YTHDF2 上调（图 3C 和 D），而搏动并没有显着影响 m6A 的writer、reader、eraser蛋白的表达。我们发现，暴露于搏动血流的 CMEC ，与 NF-κB和 PI3K-Akt 信号通路相关的分子被下调（图 3E）。 WB结果证实 PI3K 和 Akt 磷酸化减少（图 3F），表明 PI3K-Akt 信号通路失活。

图3 脉动血流可增强m6A 的修饰，但会抑制CMEC中的PI3K-Akt信号通路

(A)斑点印迹分析法检测暴露于搏动或者非搏动血流CMECs的m6A水平。(B)定量分析经搏动或者非搏动血流处理的CMECs 的m6A水平。(C)WB检测搏动或者非搏动血流处理的CMEC中不同m6A甲基化转移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）和甲基化阅读蛋白（reader）的表达。(D)使用qRT-PCR 检测 CMECs 中各种m6A甲基化转移酶（writer）、去甲基化酶（eraser）和甲基化阅读蛋白（reader）的 mRNA 表达，**p<0.01。(E)通过 qRT-PCR 筛选 CMECs 中的不同通路靶标（Wnt、Notch、NF-κB 和 PI3K-Akt 信号通路），*p<0.05，**p<0.01。(F)通过WB检测CMECs 中 PI3K-Akt 信号靶标的表达。

缩写：NP-Flow，非搏动血流；P-Flow，搏动血流；CMEC，心脏微血管内皮细胞。

为了确认 ZO-1 mRNA 是 METTL14 的靶标，进行了 RNA-RIP，结果揭示了 METTL14 和 ZO-1 mRNA 之间的直接相互作用（图 4A）。沉默 METTL14 的表达明显降低了 CMEC 中 ZO-1 mRNA 和蛋白的表达（图 4B）。接下来，用甲基化抑制剂3-脱氮腺苷（DAA）培养CMEC，该处理下调ZO-1的表达（图4C），表明METTL14介导的m6A修饰正向调节ZO-1的表达。

进行 RIP 测定并观察 YTHDF2 和 ZO-1 mRNA 之间的相互作用（图 4D）。 YTHDF2 的敲低，显着降低了 CMEC 中 ZO-1 的表达（图 4E）。此外，用放线菌素 D 处理 CMEC 以阻断转录过程，结果表明搏动血流延长了 ZO-1 mRNA 的半衰期，而这种延长效应可以通过 YTHDF2 沉默来逆转（图 4F）。

图4 搏动血流可促进METTL14介导的ZO-1 m6A 修饰并稳定ZO-1mRNA。

(A)RIP-qPCR检测METTL14与CMECs中ZO-1mRNA的相互作用，**p<0.01。(B)用METTL14-siRNAs或对照siRNAs处理的CMECs进行qRT-PCR和WB检测ZO-1的表达，**p<0.01。(C)用甲基化抑制剂3-deazaadenosine(DAA)处理 CMECs，然后进行qRT-PCR 或 WB检测ZO-1的表达，**p<0.01。(D)RIP-qPCR检测YTHDF2与CMECs中ZO-1 mRNA的结合，**p<0.01。(E)用 YTHDF2-siRNAs 或对照 siRNAs 处理的 CMECs 的 ZO-1 表达进行 qRT-PCR 和WB分析，**p<0.01。表达，**P<0.01。(F)将 CMECs 暴露于不同条件下，在放线菌素 D 处理后的不同时间点通过 qRT-PCR 检测剩余 ZO-1 mRNA。

缩写：RIP，RNA免疫沉淀；si，小分子干扰RNA；Ctrl，对照组；DAA，3-去氮腺苷；Act-D，放线菌素D；NP-Flow，非搏动血流；P-Flow，搏动血流；CMEC，心脏微血管内皮细胞。

PI3K-Akt信号激动剂740Y-P消除了搏动对CMEC中m6A修饰的影响，而当加入抑制剂LY294002时，这种影响又重新出现。此外，LY294002 在暴露于非搏动血流的 CMEC 中诱导 m6A 修饰（图 5A），表明 PI3K-Akt 信号传导调节搏动诱导的m6A修饰。接下来，我们探索了包括 USUC、 AnimalTFDB和 PROMO 在内的生物信息学数据库，然后预测了可能结合 METTL14 启动子的转录因子，如维恩图所示（图 5B）。由于 Foxo1 是 PI3K-Akt 信号传导的下游分子，我们推断 Foxo1 是 METTL14 介导的m6A修饰的转录因子。

通过Western blotting，我们证实PI3K-Akt信号磷酸化Foxo1（P-Foxo1），从而下调METTL14和YTHDF2的表达，然而，通过添加LY294002可以逆转这种效应。相反，当非搏动血流处理的 CMEC 与 LY294002 共培养时，METTL14 和 YTHDF2 的表达上调（图 5C）。此外，Foxo1的过度表达显着降低了METTL14的表达，而沉默Foxo1则增加了METTL14的表达（图5D），这表明Foxo1是METTL14的负调节因子。

为了测试 Foxo1 是否是 METTL14 的直接转录因子，进行了双荧光素酶报告基因测定和染色质免疫沉淀 ( ChIP )。Foxo1的过表达促进了CMEC中METTL14-荧光素酶活性， ChIP测定的结果表明Foxo1直接与包含METTL14推定结合元件的Foxo1-引物区域中的METTL14启动子结合（图5E）。最后，我们特意使用表达磷酸化突变体（S250A或S313A）的质粒将P-Foxo1的表达去磷酸化， METTL14和YTHDF2的表达得到恢复，同时PI3K-Akt信号的激活降低了下游靶标ZO-1蛋白质的表达。（图 5E）。

图5 Foxo1是METTL14的负转录因子，受PI3K-Akt信号通路调控。

(A)斑点印迹分析表明，PI3K-Akt信号激动剂740Y-P可抑制暴露于搏动血流的 CMECs 中的 m6A 修饰，而抑制剂 LY294002 可逆转这种效应。同样，PI3K-Akt 信号抑制剂 LY294002 也能诱导 CMECs中的m6A修饰，如下图所示。(B)维恩图说明使用三个数据库（USUC、AnimalTFDB 和 PROMO）预测的重叠转录因子。(C)使用 WB检测 PI3K-Akt 信号转导靶标 Foxo1、METTL14 和 YTHDF2 在 CMECs 中的表达。(D)通过WB检测 Foxo1 过度表达时 CMECs 中 METTL14 的表达。Foxo1 过度表达和 Foxo1 敲除时，通过 Western 印迹检测 METTL14 在 CMECs 中的表达。(E)双荧光素酶报告和 ChIP-qPCR 检测 Foxo1 与 CMECs 中 METTL14 启动子结合区的相互作用。*p<0.05；**p<0.01. (I)在指定处理下，用WB检测 Foxo1、METTL14、YTHDF2 和 ZO-1 的表达。

缩写：sh，短发夹 RNA；SI，小分子干扰RNA；lv，慢病毒；NP-Flow，非搏动血流；P-Flow，搏动血流；CMEC，心脏微血管内皮细胞。

用搏动血流 ECMO 治疗 6 小时后，我们观察到心脏组织中 METTL14 mRNA（图 6A）和 METTL14 蛋白（图 6B）水平升高。然后，通过将METTL14的慢病毒载体注射到经过非搏动血流治疗的脓毒症心肌病大鼠中，ZO-1的表达显着升高（图6C）。此外，将740Y-P（PI3K-Akt信号激动剂）注射到那些搏动ECMO治疗的大鼠中，METTL14和ZO-1的表达（图6D）显着下调，表明PI3K-Akt信号调节启动m6A体内甲基化。

接下来，进行增益或损失函数实验。通过过度表达 METTL14，非搏动 ECMO 治疗的大鼠的 LVEF 和 FS 显着改善，同时，通过用 740Y-P 激活 PI3K-Akt 信号传导，搏动 ECMO 治疗的大鼠的心脏功能显着受损（图 6E）。在免疫组织学分析中也观察到类似的结果。注射 METTL14 的慢病毒载体增加了接受非搏动血流 ECMO 治疗的大鼠中 ZO-1 的表达，而注射 740Y-P 降低了接受搏动血流ECMO 治疗的大鼠中 ZO-1 的表达（图 6F）。

图6 METTL14介导的ZO-1m6A修饰可加强脓毒症心肌病大鼠的ECMO治疗。

(A-B)使用qRT-PCR(A)和免疫组化(B)测定搏动性或非搏动血流ECMO支持的脓毒症心肌病大鼠METTL14 mRNA 和蛋白的相对表达，*p<0.05。(C)使用qRT-PCR检测METTL14过度表达时ZO-1 mRNA的表达，并注明处理方法，*p<0.05。(D)用 qRT-PCR 检测脉动血流和 PI3K-Akt 信号激动剂 740Y-P 作用下 CMECs 中 METTL14 mRNA 和ZO-1mRNA 的相对水平，**p<0.01。(E)用超声心动图测量动物模型的 LVEF和 FS。*p<0.05，**p<0.01。(F)用免疫组化方法检测了ZO-1的表达。免疫组化法检测不同实验条件下心脏组织中 ZO-1 的表达。

缩写：lv，慢病毒；NP-Flow，非搏动血流；P-Flow，搏动血流；CMEC，心脏微血管内皮细胞。

新的证据揭示了脓毒症心肌病与m6A修饰之间的密切关系，这与脓毒症诱导的免疫反应和随后的心脏损伤有关。在这项工作中，我们的研究结果表明，ZO-1的m6A修饰可以保护内皮细胞并减轻脓毒症心肌病期间的心肌炎症。 ECMO 产生的搏动血流显着改善心肌功能并促进 METTL14 介导的 m6A修饰。从机制上讲，METTL14 介导的 m6A 修饰依赖于 YTHDF2 的表达来稳定 ZO-1 mRNA，而 Foxo1 是 METTL14 的转录因子。搏动血流抑制 PI3K-Akt 信号通路，该通路启动 METTL14 介导的m6A修饰，并且 Foxo1 与 METTL14 的启动子结合，负向调节 METTL14 转录（图 7）。脓毒症心肌病是严重脓毒血症的一种亚型,具有炎症激活、心肌功能障碍、代谢紊乱、微循环障碍等一系列病理生理改变。由于微循环是脓毒血症复苏的最终目标，因此恢复微循环灌注是理想的治疗终点。越来越多的证据证实，外周血灌注不良与休克期间较高的发病率和死亡率相关。病理生理学上，交感神经系统的激活、血管通透性增加和炎症级联反应会导致外周灌注不良，进而引起内脏灌注不良、器官功能障碍，最终导致死亡。为了克服这一困境，一些研究人员之前使用对角泵组成ECMO的来提供脉动血流并提高心源性休克犬模型的生存率。目前的工作表明，ECMO 产生的搏动血流还可以增强组织灌注，改善心脏功能，并延长脓毒症心肌病大鼠的生存期。

脓毒症心肌病还包括内皮结构改变，这是继发于微循环灌注不良的，导致血管通透性和微循环破坏。 ZO-1作为内皮屏障的代表分子，对内皮完整性的重要作用已得到广泛认可。Cheng等人发现ZO-1的过度表达减轻了肠道屏障功能障碍并提高了脓毒症小鼠的存活率。Fan等人据报道，乳酸通过热休克蛋白 A12B 依赖性方式下调 ZO-1，从而损害内皮完整性。在这项研究中，我们证实了搏动血流对脓毒症心肌病大鼠内皮完整性的保护作用，因为 ZO-1 的表达和毛细血管密度大大增加。

METTL14是m6A修饰过程中的一种假甲基转移酶，广泛参与心血管疾病的病理过程。尽管如此，METTL14的上游调控机制却很少被认识。Wang等人报道，KAT2B 稳定 METTL14，从而增强巨噬细胞中 Spi2a 的 m6A修饰并抑制 NF-κB通路。Spi2a 的 m6A 修饰可使巨噬细胞失活并减轻脓毒症引起的小鼠心肌损伤。我们的研究结果表明 Foxo1 作为一种转录因子，与 METTL14 启动子结合，负向降低 METTL14 的转录。 Foxo1 被认为是一种癌症相关转录因子，是叉头框家族成员，也是 PI3K-Akt信号传导的下游分子之一。有趣的是，我们发现 PI3K-Akt 信号使 Foxo1 磷酸化，从而逆转 METTL14 介导的 m6A 甲基化。同时，我们的结果表明存在血流-微循环通讯，其中 ECMO 诱导的搏动血流使 CMEC 中的 PI3K-Akt 信号失活。然而，搏动血流如何抑制 PI3K-Akt 信号传导仍未被探索，值得未来研究。

众所周知，METTL4 具有多种生物学功能，我们发现ECMO 提供的搏动血流增加了 METTL14 激活的 CMEC 中的 m6A 水平。在搏动条件下，METTL14 通过 ZO-1 的 m6A甲基化发挥脓毒症心肌病的保护基因作用，在YTHDF2 存在时稳定 ZO-1 mRNA。虽然ZO-1在搏动血流下被认为是METTL14的靶基因，但我们无法确认METTL14是否还有其他靶基因影响结果。还值得注意的是，全面沉默 METTL14 对于脓毒症心肌病大鼠来说是致命的。脓毒症心肌病大鼠的 METTL14 功能丧失测定结果不令人满意。其他表观转录组机制可能发挥作用，并且可以使用多组学来揭示更详细的机制。

VA-ECMO治疗对脓毒症心肌病患者有益处，但生存率仍然令人失望。传统ECMO的一个主要缺点是无法提供仿生搏动血流，理论上对微循环复苏影响不大。VA-ECMO 技术的最新发展是对血泵进行改造，以实现搏动血流，例如i-Cor和K-Beat系统。其功效尚未达成共识，而缺乏搏动血流标准化是罪魁祸首。我们的工作首次研究了搏动血流对脓毒症心肌病和内皮细胞动物模型的影响，强有力的发现支持搏动血流对脓毒症引起的微循环衰竭的治疗作用。机械循环支持装置的未来发展最好包括搏动选项。

ECMO 产生的搏动血流可显着改善心肌功能，并诱导METTL14 介导的 m6A 对 ZO-1 mRNA 的修饰，从而保护内皮并减轻脓毒症心肌病的心肌炎症。搏动血流抑制 PI3K-Akt 信号通路，其中下游分子 Foxo1 抑制 METTL14 介导的 m6A 修饰。增强微循环灌注的治疗方法可应用于未来脓毒症心肌病的治疗。未来包含搏动选项的机械循环支持装置应该更加理想。