青委专刊 | 低温对大鼠体外循环术后脑神经炎症和冷休克反应的不同影响

低温对大鼠体外循环术后脑神经炎症和冷休克反应的不同影响

目标温度管理（TTM）是体外循环（CPB）手术中的一种神经保护措施，机制可能是通过激活冷休克蛋白来实现的。因此，我们研究了浅低温和深低温对大鼠CPB术后神经炎症反应和冷休克蛋白表达的影响。

Wistar大鼠在CPB或对照组中接受1小时的轻度（33℃）或深度（18℃）低温处理。术后第1天（短期）或术后第3天和第7天（长期），利用TSPO配体11C-PBR28进行PET扫描，以评估神经炎症。短期组的第1天获取海马和皮质样本，长期组在第7天获取。使用RT-PCR分析M1和M2型小胶质细胞相关细胞因子的mRNA表达。通过Western Blot确定冷休克蛋白RNA结合基序3（RBM3）和酪氨酸受体激酶B（TrkB）受体蛋白的表达并进行量化。

 两组均在一小时内达到目标温度。CPB大鼠在术后第1天和第3天的[¹¹C]PBR28的标准摄取值（SUV）与对照组的相似。与CPB 33℃组相比，CPB 18℃组在术后第7天杏仁核和海马区的SUV显著升高。在TTM 18℃和33℃之间，M1和M2型小胶质细胞相关细胞因子的表达没有差异。在术后第1天和第7天，CPB 33℃组与CPB 18℃组和对照组33℃组相比，皮层和海马区的RBM3蛋白水平显著升高。

  与33℃的TTM相比，18℃的TTM在CPB过程中加剧了杏仁核和海马的神经炎症反应。此外，与18℃的TTM相比，33℃的TTM增加了CPB大鼠皮质和海马中TrkB和RBM3的表达。这些数据表明，33℃的TTM可能通过诱导冷休克蛋白的保护机制来减轻神经炎症。

神经认知功能障碍是心脏手术后常见的并发症。根据神经认知功能障碍诊断标准不同，心脏手术后3个月的发病率在8%至27%之间。尽管体外循环（CPB）技术、手术和麻醉技术有了长足进步，但是在接受心脏手术的老年患者中，神经功能损伤仍然是需要关注的问题。导致神经认知障碍的病理生理机制很多，包括血脑屏障破坏、脑灌注不足、脑血管自动调节受损、脑微栓子以及全身性炎症和神经炎症。除其他因素外，神经炎症的调节与小胶质细胞激活的有关。

小胶质细胞是驻留在大脑中的巨噬细胞，在突触活动，功能可塑性和神经发生中发挥着重要作用。根据刺激的不同，小胶质细胞会在激活谱上从促炎表型（即M1样小胶质细胞）到抗炎表型（即M2样小胶质细胞）极化。M1样小胶质细胞表达如IL-1β、TNF-α、IL-6和NOS2等细胞因子，从而加剧神经炎症、氧化应激和神经变性。M2样小胶质细胞则通过产生如TGF-β、IL-4和IL-10等细胞因子来调节轴突再生、突触可塑性和血管生成，从而促进组织修复。

治疗性低温是一种神经保护措施，可减轻心脏手术期间及术后的神经损伤。低温的神经保护作用与多种机制相关，包括温度依赖性的代谢减少，从而减少氧需，以及通过减少多巴胺和谷氨酸等兴奋性神经递质的细胞外水平来防止中枢神经过度兴奋。此外，低温可减少自由基的形成并抑制细胞凋亡。在低温状态下，虽然总的蛋白合成减少，但是包括冷休克蛋白RNA结合蛋白基序3 ( RBM3 ) 在内的几种RNA结合蛋白的表达增加。RBM3的表达受酪氨酸受体激酶B（TrkB）信号的调节，当RBM3水平升高时，它可防止突触和神经元的丧失。此外，RBM3在细胞应激情况下对转录后mRNA调控和蛋白质合成也非常重要。尽管治疗性低温可能具有神经保护的作用，但低温也可能导致一些不利影响，如凝血障碍和感染风险增加。

虽然低温的神经保护作用广为人知，但只有少数研究比较了不同目标温度对CPB术后神经炎症反应的影响。此外，迄今为止，还没有证据把低温的程度与CPB术后的神经炎症和冷休克蛋白表达联系起来。因此，本研究的目的是通过检测小胶质细胞激活和冷休克蛋白表达研究神经炎症反应，来探讨浅低温（33°C）和深低温（18°C）对心脏手术后神经炎症的影响。

德国查尔斯河实验室提供的成年雄性Wistar Crl大鼠（n = 39），体重超过450克，纳入实验。随机分组基于以下三个条件：1) 体外循环（CPB）或对照组（未手术）；2) 深低温（18°C）或浅低温（33°C）；3) 短期（术后第1天）或长期（术后第3天和第7天）正电子发射断层成像（PET）扫描方案（共8组，每组n = 3-4）（图1）。从第一次PET扫描前开始，大鼠被单独饲养在12小时的光/暗循环中，并可以自由获取食物和水。所有实验均获得格罗宁根大学动物护理与使用委员会（参考编号DEC6092）的批准，并遵循动物研究行为标准的指导原则。

使用5%的异氟烷诱导麻醉，经鼻锥给予含有2-3%的异氟烷的氧气/空气（1:1）混合气体来维持麻醉。大鼠接受气管插管和机械通气（阿姆斯特丹婴儿呼吸机；HoekLoos，荷兰，阿姆斯特丹），呼吸频率为每分钟80次。尾静脉置管（22号插管），用于静脉麻醉。皮下单次注射阿托品（40 µg/kg）防止气道分泌物过多。使用柔性温度探头持续监测直肠温度。罗库溴铵（0.5 mg/kg）用作肌肉松弛剂。左股动脉置管（26号插管），用于监测血压。随后通过持续静脉输注氯胺酮（70 mg/ml）来维持麻醉，手动调整使输注速度维持在1.2至1.5  ml/hr之间。在CPB期间，小剂量芬太尼（40 µg/kg ）分次静脉推注。平均动脉压维持在60至100 mmHg之间。

所有动物均按标准化方案进行降温，除了利用动物床垫降温外，CPB组的大鼠可以通过CPB回路中的低温血液进行内部降温，而对照组大鼠则是通过腹部包裹的冰袋进行外部降温。

我们的CPB模型参考并改良了Samarska等人，特点是小型化的循环管路允许在不输血的情况下进行CPB，并可通过CPB管路对大鼠进行额外降温。在CPB插管之前，给予3000 IU/kg的肝素。左颈动脉插入22插管作为CPB动脉输入端。一个多孔的4.5 French插管（由荷兰Cook Son公司的Desilets-Hoffmann导管改制）经右颈静脉进入到右心房。

体外循环装置包括一个玻璃静脉储血槽、一个软管泵（Watson Marlow 120S）、一个新生儿膜式氧合器（0140GM，Polystan，Vaerlose，Denmark）和一个带内置气泡收集器的玻璃逆流热交换器。所有部件都通过聚乙烯管道（内径1.6毫米）连接。静脉储血槽和热交换器在使用前都经过了清洁和灭菌。CPB管路按照方案进行预充。

在手术过程中，心率和血氧饱和度由MouseOxPlus 脉搏血氧仪进行持续监测（Harvard apparatus）。分别在降温15分钟后（体温= 30-33°C）、降温55分钟后（体温= 33°C或18°C）以及在脱机拔管时（体温= 35°C）采集血样。氧合器的气流量维持在800 ml/min，氧气与空气的比例为1:4。目标CPB流量为每分钟100-120 ml/kg 。CPB开始后，CPB33组的氯胺酮输注速率降低到初始输注速率的40-50%，CPB18组则降为10-20%。血样进行分析采用α-stat法，于CPB开始后15、55分钟以及在移除CPB插管后抽取100 µl血液，CPB过程中的血样从左侧股动脉插管处采集。动物固定在CPB机器上持续1小时，之后开始复温。复温除使用加热垫外，还可用温水加热CPB管路或在对照组中通过暖风机来进行的，复温的速度为每5分钟提高2℃。为防止术后高热，主动复温至核心体温35°C后，停止加热CPB管路和吹暖气，仅用加热垫进行复温。CPB脱机后，鱼精蛋白（1500 IU/kg）单次静脉注射。拔除插管后，缝合伤口，并逐渐停止麻醉。当大鼠苏醒后，拔除气管插管。单次皮下注射布托啡诺（10 µg/kg）作为术后镇痛。脱机后，动物被放置在加热的笼子中恢复至少4小时。所有实验均在上午8:00至12:30之间进行。

为了评估神经炎症反应，利用TSPO配体[¹¹C]PBR28进行PET检查，[¹¹C]PBR28是一种用于检测小胶质细胞活化的示踪剂。在CPB手术之前、短期组术后第1天以及长期组术后第3天和第7天进行PET扫描。将大鼠转运到用于小动物的PET机器后，在未禁食的大鼠中用5%的异氟烷混入氧气来诱导麻醉，用2%的异氟烷维持麻醉。[¹¹C]PBR28（12.1 ± 3.7 MBq，7.6 ± 0.5 ng/l）用0.9%的生理盐水稀释后，经阴茎静脉一次性推注。大鼠清醒30分钟后，用异氟烷再次麻醉，以便在PET 扫描仪（MicroPET Focus 220，Siemens）中定位。在[57Co]透射扫描后，大鼠进行了30分钟的发射扫描，发射扫描在[¹¹C]PBR28注射后45分钟开始。发射扫描的列表模式数据在散射和衰减校正后，被重建为单个时间帧（注射后45-75分钟）。采用2D-OSEM算法对Fourier正弦图进行重建，迭代4次，子集16个。大鼠在完成PET扫描，并在安静的环境中复苏后送回至饲养处。

最后一次PET扫描结束后，大鼠在深度麻醉下通过腹主动脉放血处死，同时用生理盐水持续冲洗2分钟。取出器官，立即冷冻或在4%的多聚甲醛（PFA）中固定保存以供后续分析。断头后将脑组织从颅骨中取出，根据大脑区域（包括皮层和海马体等）立即进行解剖，没有发现组织坏死或脑梗死。

使用PMOD 3.6软件（PMOD Technologies Ltd.）分析PET扫描数据。扫描图像会自动注册到一个[¹¹C]PBR28特定的PET模板上，该模板是根据Vállez Garcia等人描述的方法构建。脑放射性浓度通过一组预定义的感兴趣体积（VOIs）计算，以标准摄取值（SUV）表示：平均组织活性浓度[kBq/cc] /（注射剂量[kBq] / 体重[g]）。假设1cc组织的质量为1g。

为了研究M1和M2型小胶质细胞的激活情况，我们按照之前描述的方法进行了RNA提取和定量RT-PCR的基因表达分析，不同之处在于，我们使用NanoPhotometer N60（Implen, Thermo Fisher Scientific, Landsmeer, the Netherlands）来测量RNA产量。使用了以下Assay-on-demand引物/探针组：GAPDH（Rn01775763_g1）、IL1b（Rn00580432_m1）、IL4（Rn01456866_m1）、IL-6（Rn00561420_m1）和IL10（Rn00563409_m1）。其中，IL1b和IL-6用于检测M1型小胶质细胞的激活，而IL-4和IL-10用于检测M2型小胶质细胞的激活。

为了测量皮层和海马体中TrkB和冷休克蛋白RBM3的表达，首先将脑样本在RIPA-TBS缓冲液中匀浆，然后在4℃下以14,000 rpm的转速离心20分钟。使用Bradford蛋白测定法（BioRad，荷兰）确定蛋白质浓度。在4-20% PreciseTM蛋白凝胶（Thermo Scientific）上利用SDS-PAGE分离等量的总蛋白（在SDS-PAGE样品缓冲液中）。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（BioRad）上后，用5%的牛血清白蛋白封闭。然后，将膜在4℃下与一级抗体孵育过夜，随后在室温下与二级抗体孵育1小时。使用的一级抗体如下：兔多克隆抗RBM3（14363-1-AP，Proteintech，英国）和兔多克隆抗TrkB（4606S，Cell Signalling Technology，美国），以兔单克隆β-肌动蛋白（4967S，Cell Signalling Technology，美国）作为加载对照。使用的二级抗体是辣根过氧化物酶结合的抗兔抗体（W4018，Promega，美国）。使用Novex ECL HRP化学发光底物试剂盒（WP20005，Invitrogen，美国）检测信号，并使用ChemiDoc（BioRad，英国）的软件通过密度测定法进行量化。

使用Windows版本的SPSS 22.0进行统计分析。使用Sigmaplot 14.5版（Systat Software Inc.，芝加哥，美国）和GraphPad Prism 8.0.1（GraphPad软件公司，拉霍亚，加利福尼亚州，美国）创建图形。通过Kolmogorov-Smirnov检验测试分布的正态性。连续数据的差异使用ANOVA（参数数据）和Kruskal

Wallis（非参数数据）检验。数据以平均值±标准误（SEM）或中位数（25th-75th百分位）表示。P<0.05表示差异有统计学意义。

共随机分配了39只大鼠随机进行实验，其中29只完成了实验和PET扫描（图1）。10只大鼠被排除在研究之外，这主要与CPB过程中遇到的技术问题（n=2）和在18℃ 停机后出现肺部问题（n=4）有关。此外，一只大鼠在18℃停机后直接死于低血压休克，另有3只在33℃脱机的大鼠，在24小时内死于饲养的笼子。

尽管对照组动物的深低温仅依赖于外部降温，但我们能够以与CPB大鼠相似的速率冷对其进行降温（图2）。在CPB组中，平均需要10（8-16）分钟达到目标温度33℃，而在对照组大鼠中平均需要7（6-7）分钟。CPB组中需要48（45-49）分钟完成降温至18℃，而在对照组中需要54（52-56）分钟完成。复温后，记录的最后温度在所有治疗组中相似。在脱机过程中，核心温度保持在37.5℃以下。

由于管路的液体预充，与对照组大鼠相比CPB组大鼠血细胞比容值都显著降低。然而，收集CPB系统中的全部血液并通过静脉回输，在麻醉复苏后两组大鼠的血细胞比容差异消失。除了CPB降温期间血细胞比容显著降低以及碱剩余和pCO2的差异外，所有变量在脱机时已接近于对照值。动脉血测量数据如图3所示。

图4展示了在18℃和33℃下，CPB和对照组大鼠在术后第1天、第3天和第7天的[¹¹C]PBR28轴向切片的PET图像。图像显示在CPB18组中，左前半球（海马前部）有高示踪剂摄取，表现为荧光绿色热点。表1展示了所有大鼠在CPB手术后各区域的[¹¹C]PBR28脑摄取情况。术前SUV在各组之间没有差异，并且与术后第1天的SUV相似（补充材料1）。在第1天，CPB18 组与CPB33组在任一脑部区域的SUV都没有显著差异。第3天后，温度组之间的SUV相似，但CPB18组有趋向更高值的趋势（图5）。在第7天，CPB18组的海马和杏仁核SUV显著高于CPB33组（分别为p=0.031和p=0.025；图5）。在所有对照组大鼠中，温度组之间或与基线相比在任何时间点的SUV没有显著差异，对照18组与对照33组之间也没有更高SUV的趋势（补充材料2）。

为了追踪SUV随着时间的变化，我们将所有脑部区域的术前SUV与术后第1天、第3天和第7天的SUV进行了相关分析。术前扫描数据与CPB和对照组任何时间点的数据之间没有相关性。然而，分析来自同一动物的第3天和第7天的SUV时，我们发现杏仁核（r = 0.946）、海马（r = 0.907）、苍白球（r = 0.964）、纹状体（r = 0.927）和皮质（r = 0.935）在第3天和第7天的SUV之间存在显著相关性，所有区域的p < 0.001，表明存在持续的神经炎症反应。相反，在脑干、小脑、前额皮质和下丘脑中，第3天和第7天的SUV水平没有相关性。

为了评估M1/M2极化，我们分析了接受CPB的大鼠皮层和海马区中M1和M2相关细胞因子的表达。我们发现CPB33和CPB18之间M1和M2相关细胞因子的mRNA表达没有差异（图6）。此外，在短期和长期随访的大鼠中，皮层和海马区的M1和M2小胶质细胞的标志物也没有差异。

在第1天和第7天，我们分析了皮质和海马中的TrkB受体和RBM3蛋白水平。在第1天，CPB33和CPB18组皮质中的TrkB和RBM3蛋白表达与对照33组和对照18组没有差异。然而，与CPB18相比，CPB33在第1天皮层中的TrkB和RBM3表达增加（图7A、B；p值分别为0.007和0.019）。在第7天，所有组的皮质中TrkB和RBM3蛋白表达相似。

在海马区，第1天所有组的TrkB蛋白表达水平相似（图7C）。然而，在第7天，CPB33与对照组33相比，海马区TrkB显著增加（p=0.042），但与CPB18没有差异。海马区RBM3表达也呈现类似现象，即第1天所有组相似，但在第7天CPB33组显著高于对照33组（p=0.027；图7D）。

本研究的目的是探讨轻度和深度低温对CPB后大鼠神经炎症反应和冷休克蛋白表达的影响。我们证明，与33℃下的CPB相比，在18℃下进行的CPB与第7天海马和杏仁核中更高的小胶质细胞激活相关。在CPB短期和长期组中，我们没有观察到M1和M2小胶质细胞相关细胞因子的mRNA表达差异。尽管CPB代表了一种应激模型，但在CPB33组的大鼠中任何时间点都没有发现神经炎症的迹象。此外，我们发现CPB33组大鼠组织中TrkB受体和RBM3的表达增加，而在CPB18组中没有诱导。这些数据表明，在33℃下进行的CPB辅助手术在神经保护方面可能优于18℃下进行，这与皮质和海马中冷休克蛋白的表达增加有关。

此外，在接受CPB的患者中，全身炎症、脑微栓塞、脑低灌注和脑缺血-再灌注损伤被认为是导致中枢神经损伤的因素。在接受CPB辅助主动脉弓重建术的新生儿中，经历约30分钟的深低温停循环后，就会在脑循环中立即观察到炎症反应。在一项动物研究中，绵羊在轻度低温下经历3小时CPB后，形态学分析直接观察到小胶质细胞的激活。在我们的研究中，术后第1天没有观察到小胶质细胞激活的显著升高。如果我们在更早的时间点进行测量，可能会检测到早期的小胶质细胞激活，但这种差异也可能是由于动物模型或小胶质细胞激活评估方法的不同引起的。此外，尽管之前假设单独的深低温可能会引起神经损伤，但在我们的研究中，无论是深度还是轻度低温都没有增加对照组大鼠中[¹¹C]PBR28的摄取。然而，在比较CPB18和CPB33的神经炎症反应时，我们发现深低温与CPB后第7天海马和杏仁核中小胶质细胞的更高激活相关。这与我们发现的深低温下神经炎症反应增加一致，越来越多的证据表明深低温对神经结果有不利影响。深低温停循环后可出现永久性神经功能障碍和脑组织病理损伤。在我们的研究中，接受轻度低温CPB的大鼠在任何时间点都没有发现神经炎症的迹象。据我们所知，在CPB模型中，还没有关于轻度和深度低温对小胶质细胞激活的影响的研究。在其他条件下的研究，包括短暂性全脑缺血，表明轻度低温对小胶质细胞激活有益。在大鼠短暂性全脑缺血模型中，与正常体温相比，无论是36℃还是33℃的TTM都显著抑制了M1型小胶质细胞的激活。在同一研究中，低温没有促使小胶质细胞向有益的M2表型极化，从而提出TTM不诱导小胶质细胞向抗炎表型极化，而是阻止其激活的假设。然而，其他研究表明轻度低温可促使小胶质细胞向M2表型极化。虽然我们没有证明M1和M2小胶质细胞相关的细胞因子表达存在差异，但轻度低温组中无神经炎症发生支持了轻度低温抑制小胶质细胞激活的假设。总体而言，轻度低温在预防小胶质细胞激活方面似乎优于深度低温。

冷休克蛋白RBM3被认为在低温诱导的神经保护中起关键作用。虽然高温会使RBM3下调，但即使温度从37℃小幅降低到32-34℃也足以诱导RBM3的表达。在小鼠海马切片培养中，与正常体温相比，33℃时RBM3蛋白上调。相反，暴露于深度低温并未显著上调RBM3。与这些发现一致，我们的研究证实在CPB后第7天，33℃组的海马和皮质中RBM3蛋白水平高于18℃组。此外，我们发现RBM3的调控因子TrkB的表达与RBM3的表达相关，从而支持了关于RBM3表达的研究结果。同时出现的神经炎症反应可能在TrkB和RBM3的诱导时间中起作用，因为在第7天海马组织中观察到最高的表达。在CPB18组中，海马中[¹¹C]PBR28的摄取量第7天最高，而CPB33组的摄取水平与术前水平相似。这表明CPB33组中较低的小胶质细胞激活可能与RBM3的上调有关。

本研究的几个局限性必须加以说明。首先，如图2所示，18℃组的大鼠与33℃低温组所经历的降温模式不同。33℃组的大鼠在33℃下维持约一小时，而18℃组的大鼠体温持续下降，仅在复温开始前几分钟达到目标温度。因此，18℃组大鼠的平均温度高于18℃的目标温度。其次，由于左侧颈动脉插管，CPB血流进入方向指向主动脉，左半球的脑血流量取决于Willis环的充分性和通性，跟人类一样在大鼠的Willis环也不尽相同。因此，左半球的脑血流量可能低于右半球。第三，33℃组的氯胺酮输注速率高于18℃组。氯胺酮是一种强效的NMDA受体拮抗剂，33℃组中的较高剂量可能通过减少中枢神经系统的过度兴奋发挥保护作用。此外，已知氯胺酮治疗会诱导BDNF的产生，这是一种参与TrkB介导的RBM3表达因子。此外，CPB33组中较高的氯胺酮输注速率可能通过诱导TrkB信号传导导致RBM3的上调。第四，血细胞比容和动脉pO2的大幅下降可能导致组织缺氧，这在人类CPB中是不可接受的。第五，CPB组的pO2和sO2低于对照组。由于我们的研究中没有进行心脏停搏，心脏在整个CPB期间继续跳动并有心输出量，而在CPB期间肺通气停止。因此，一部分血液通过肺部流动，低氧分压血液进入近端主动脉，与来自CPB的氧合血混合，降低了降主动脉和其余动脉循环中的动脉血氧含量。因此，由于残余心输出量的低氧血与氧合血的混合导致低于预期的pO2和sO2。另一个原因可能与所选择的麻醉剂有关。氯胺酮通过兴奋交感，增加心率和心输出量，这可能导致通过肺部循环的血液量增加，通过氧合器的血液比例降低。此外，氯胺酮还可以增加大脑和其他组织的代谢率，从而增加氧气消耗。最后，我们研究中的CPB持续时间为1小时，与人类CPB的平均持续时间相比较短。

总之，与33℃的TTM相比，18℃的TTM增加了接受CPB手术的大鼠杏仁核和海马的神经炎症反应。此外，与18℃的TTM相比，33℃的TTM诱导了CPB大鼠皮质和海马中TrkB和RBM3的表达增加。这些数据表明，33℃的TTM可能通过诱导冷休克蛋白的保护机制来减轻神经炎症。因此，在接受CPB心脏手术患者中，轻度低温可能是一种改善术后认知结果的潜在策略。

图1. 实验分组

图3. CPB或对照组过程中的动脉血测量值，分开始降温后15分钟

或55分钟以及复苏期间采集。CPB组和对照组在18℃或33℃下存在的显著差异分别用*/**表示，分别对应p < 0.05和p < 0.01。

图4. 在18℃和33℃下，CPB手术和未手术大鼠在手术后1天、3天和7天的代表性轴向PET图像，显示了[¹¹C]PBR28的活性。

图5. CPB前以及术后第1天、第3天和第7天，于18℃和33℃下接受手

术的大鼠杏仁核（A）和海马区（B）对[¹¹C]PBR28的标准化摄取值。显著性差异用*表示，对应p < 0.05。

图6. CPB的大脑皮质和海马体中il-1β、il-4、il-6和il-10的mRNA水平

图7. CPB和未手术大鼠在术后第1天和第7天的冷休克蛋白分析。

18℃（蓝色和灰色条）和33℃（红色和粉色条）。

表1大脑各区域[¹¹C]PBR28的标准化摄取值