青委专刊 | 心力衰竭、左心室辅助装置和心脏移植患者的骨骼肌减少症指数变化与炎症、肠道和口腔微生物群的相关性

心力衰竭、左心室辅助装置和心脏移植患者的骨骼肌减少症指数变化与炎症、肠道和口腔微生物群的相关性

骨骼肌减少症以肌肉质量和功能丧失为特征，在心力衰竭(HF)中普遍存在，预示着不良预后。我们研究了HF、左心室辅助装置(LVAD)和心脏移植(HT)患者骨骼肌减少症指数(sarcopenia index ,SI)的变化，并评估了其与炎症和消化道(肠道和口腔)微生物群的关系。

我们纳入了460例HF、LVAD、HT患者。在一部分LVAD和HT患者中进行了前瞻性的手术前/手术后的重复测量。分别在271份和622份血液样本中检测SI（血清肌酐/胱抑素C）和炎症生物标志物（C反应蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子）。通过对335份粪便和341份粪便样本的16S rRNA测序， 评估了肠道和唾液微生物群。多变量回归分析评估了SI和i)纽约心脏协会心功能分级；ii)LVAD或HT前后；iii)炎症和微生物多样性的生物标志物之间的关系。

中位数（四分位数范围）自然对数（ln）-SI为-0.13（-0.32,0.05）。Ln-SI在HF级别恶化时下降，在LVAD和HT后1个月进一步下降，并随着时间的推移而升高。Ln-SI与炎症（r=-0.28，p<0.01 ）、肠道（r=0.28，p<0.01）和口腔微生物多样性（r=0.24，p<0.01）相关，这些相关性在对联合队列进行多变量调整后仍然显著，但并非所有个体队列都如此。肠道罗氏菌群的存在与SI的增加有关。

有症状的心衰患者的SI水平降低，并在LVAD和HT后长期保持下降。在联合队列中，SI水平与炎症以相似的方式共同变化，并与整体微生物（肠道和口腔）多样性显著相关，包括特定类群的组成变化。

关键词：骨骼肌减少症、微生物群、炎症、心力衰竭、左心室辅助装置、心脏移植。

心力衰竭（HF）是一种多方面的危及生命的综合征，与显著的死亡率和发病率相关。尽管慢性心衰的治疗取得了进展，但疾病仍在发展，终末期心衰挽救生命的治疗选择仅限于心脏移植（HT）和左心室辅助装置（LVAD）。心力衰竭进展的特征是淤血、炎症和氧化应激的增加，导致终末期心衰的临床综合征，通常表现为多器官系统功能障碍和全身持续性消瘦，包括骨骼肌减少症。骨骼肌减少症是一种以肌肉质量和功能丧失为特征的骨骼肌疾病；它与心衰的预后密切相关。促进这些炎症、氧化反应和包括骨骼肌减少症在内的临床后遗症的机制尚不完全清楚。此外，骨骼肌减少症的诊断需要复杂的多模式评估，使临床诊断具有挑战性。基于骨骼肌细胞产生的血清肌酐（Scr）和由所有有核细胞产生的胱抑素C（CysC）获得的骨骼肌减少症指数（SI），是一种现成的生物标志物，已作为几种疾病人群中骨骼肌质量的可靠指标。

胃肠道包含一个动态的微生物群落，与大量的粘膜表面密切接触。最近的证据表明，肠道和口腔微生物群是心衰发病机制的重要因素。具体来说，微生物群落失衡，其特征是多样性的改变（生态失调），病原体的聚集和有益菌群的耗尽(如短链脂肪酸（SCFAs）的产生者）可能进一步刺激HF的炎症反应和氧化应激导致病情恶化。包括我们工作在内的一些临床研究已经报道了肠道微生物群和心衰之间的联系。最近，动物模型证明了肠道微生物组成和骨骼肌质量和功能之间的机制联系，通常被称为肠道-肌肉轴。有限的人类数据表明，骨骼肌减少症患者的SCFA潜在菌群和促进氨基酸（AA）代谢菌群的肠道微生物多样性降低甚至耗竭，而心衰患者则没有相关数据。与肠道微生物群相似，口腔微生物群通常与各种全身性炎症性疾病有关，特别是与几种心脏代谢结果有关。

在该大型HF、LVAD和HT的患者队列中，我们试图i)描述不同HF分级（NYHA心功能I-IV级）以及LVAD和HT后的多个时间点的SI变化；ii)描述在LVAD和HT后的多个时间点肠道和口腔微生物的变化；和iiii)证实SI与炎症、肠道和口腔微生物多样性的生物标志物之间的关系，特别是参与SCFA产生和AA合成的菌群。

该前瞻性研究纳入2016年6月至2019年2月在哥伦比亚大学欧文医学中心（CUIMC）进行LVAD或HT手术的常规临床随访或首次住院期间的患者。排除标准为(1)左心室射血功能（LVEF）>50%的心衰患者；(2) 浸润性和肥厚性心肌病；(3)需要透析的晚期肾脏疾病；(4)肝硬化或活动性肝炎；(5)存在活动性恶性肿瘤。多器官移植受体被排除在这个队列之外。

患者分组为HF I、II、III、IV级；LVAD后：1个月、3个月、6个月、12个月；或HF后：1周、1个月、3个月、6个月、12个月。从电子病历（EMRs）中提取人口统计学和临床信息。NYHA分级由患者的心脏病医生进行，并由2名HF专家(M.Y.和P.C.C.) 判定，他们对研究结果一无所知。心衰患者在研究中按照心衰管理指南进行治疗，HT患者按照医疗机构方案接受标准的免疫抑制治疗。电子病历中记录了粪便和/或血样采集前1个月的抗生素使用情况（围手术期和治疗期间）。该研究得到了哥伦比亚大学欧文医学中心机构审查委员会（AAAP8204）的批准，参与者签署书面知情同意。本研究符合ISHLT的伦理声明。

测定血浆中炎症的生物标志物（CRP、IL-6、TNF-a)， 为每个炎症生物标志物创建标准化的z分数，并汇总为至少有两种炎症生物标志物可用于统计分析的患者的炎症z分数。SI计算为sCr /CysC值，并在统计分析前进行自然对数转换。

患者用无菌粪便采样杯提供粪便样本。补充资料中提供了粪便和唾液采集、DNA提取和16S rRNA测序的详细信息。

胸部计算机断层扫描（CT）肌肉质量分析：使用CT测量的胸肌面积，对具有相应SI测量值的患者亚组进行肌肉质量定量分析。

在R 4.2.2版本中，使用DADA2来识别准确的序列变体(ESV)，使用Phyloseq软件包进行16S分析。利用Shannon指数定义α多样性(即样本内菌群的数量和分布)。

描述性分析用均数（标准误差）或数字（%）表示，组间差异的p值来自方差分析（连续变量）或卡方检验（分类变量）。根据患者类型（HF、LVAD或 HT）分别对患者类别（NYHA分级、LVAD或HT后的时间）的微生物多样性测量以及肌肉减少症和炎症的生物标志物进行回归分析。该分析采用广义线性混合效应模型，将患者作为随机效应处理，以解释LVAD和HT患者的重复抽样。模型中包含了LVAD或HT后的时间变量，以检测时间作为我们结果变化的预测因子。从这些分析中，我们获得了方差分析结果和相应的F统计数据，以检验我们的假设，即结果（微生物组多样性、SI或炎症评分）在以下方面没有差异：i)患者类型（HF、LVAD或HT）；ii)心衰患者的HF分级；或iii)LVAD和HT患者干预后的时间。同样，我们使用混合效应线性回归模型来评估肠道或唾液微生物组测量值（自变量）与炎症或SI（因变量）之间的关系。在所有分类变量的基础上计算结果的调整和未调整的最小二乘均值。模型根据年龄、性别、种族/民族，以及抗生素的使用进行了调整。稀有门（平均相对丰度<0.5%）被归类为“其他”。DESeq2研究了患者类别、SI或炎症与门水平相对丰度（因变量）之间的关系。通过将菌群水平变量操作为存在与不存在，然后对该二分变量的SI值进行回归，进行属或种水平的分析。样本中存在少于10%或超过90%的类群被排除在分析之外。使用伪发现率来校正多重比较。我们展示了FDR<0.05的类群的结果，或基于对已知AA代谢或SCFA合成功能的菌属的文献综述而预先选择的类群的结果。

本研究纳入了460例HF、LVAD和HT患者。提供血液样本的患者的基线特征见表1至表3，提供粪便和唾液样本的患者特征见补充表S1和S3。在460例患者中：i) 271例有Cys-C和sCr数据可用于计算SI（7例HF I级、20例II级、34例III级、85例IV级、90 例LVAD和127 例HT）；ii) 335例有肠道微生物群数据（8例HF I级，36例II级、45例III级，72例IV级、100 例LVAD和145例 HT）；iii) 341例有唾液微生物群数据（11例HF I级，42例II级，59例III级，55例IV级，111 例LVAD和124例 HT）。纳入的261例心衰患者中，103例（39.4%）进展为需要LVAD或HT。

总体而言，患者主要是白人男性，各HF分级在年龄和心衰病因方面没有差异。

在38例HF、LVAD和HT患者的亚组中，在SI测量后0-14天(中位3天)内可获得SI和胸部CT数据，对PMI（cm2/m2)和ln-SI进行相关性分析（r=0.46（0.25-0.62），p<0.0001）。

整个队列的中位数（四分位数范围）ln-SI为-0.13（-0.32,0.05），ln-SI在不同患者类别中的分布如图1A所示。在调整后的回归模型中（图1B），平均ln-SI值随着HF NYHA分级的恶化而降低；HF Ⅳ级患者的平均ln-SI值显著高于LVAD 1个月(P<0.0001）、HT 1周（P<0.0001）和HT 1个月（P<0.0001）。平均ln-SI值随LVAD和HT后的时间增加而升高，但与有症状的心衰患者中观察到的水平没有显著差异。

整个队列的肠道Shannon指数的平均值（SD）为5.81±0.63。不同患者类别的变化如图2A所示。经过多变量调整后（图2B），肠道Shannon指数的平均水平在所有患者类别中存在差异（HF、LVAD和HT之间的任何差异p=0.04），在恶化的HF NYHA分级中，多样性降低的趋势无统计学意义（趋势p=0.29）。最低的平均Shannon指数值出现在LVAD或HT后的第一个月，HT后的多样性随时间的推移呈显著增加趋势（趋势p<0.0001），但LVAD后不显著（趋势p=0.46）。

唾液Shannon指数的平均值(SD)为2.84±0.70。唾液Shannon指数在不同患者类别中的变化如图2C所示。经多变量调整后(图2D)， 唾液Shannon指数的平均水平在所有患者类别或HF分级中均无显著差异。唾液Shannon指数的平均值在LVAD和HT后的第一个月最低，随着时间的推移，多样性有明显增加趋势。

在门水平对肠道微生物群的分析中，LVAD和HT后，变形菌门的平均相对丰度似乎立即增加，厚壁菌门立即下降，并随着时间的推移，向心衰患者中观察到的组成转变（图3A）。对唾液的门水平分析中（图3B），门水平的相对丰度变化较小，即使在LVAD或HT之后，似乎也没有发生显著变化。总的来说，考虑到组间样本量的巨大差异和显著的多重比较问题，统计假设检验的能力很低，应该谨慎解释观察到的现象。

平均炎症评分水平在不同患者类别之间存在显著差异（任何差异p<0.0001，图S2）。随着HF NYHA分级（趋势p<0.0001）的恶化，炎症反应加重，而炎症评分随着LVAD（趋势p<0.0001）和HT（趋势p=0.005）后的时间而下降。值得注意的是，LVAD后的早期观察到的炎症评分最高。CPR、IL-6和TNF-α的个体差异如图S3所示。

表S3列出了微生物多样性（口腔和肠道）与炎症之间的关系。肠道多样性的增加与炎症评分的降低相关，而口腔多样性则没有。

骨骼肌减少症指数、炎症评分、肠道与口腔Shannon指数的关系

262名参与者的ln-SI与炎症评分之间的关系如图4A所示。当分析整个队列时，ln-SI与炎症评分呈中度负相关（r=-0.28，p<0.01）。这种关联在LVAD亚组和HT亚组中有显著的相关性，但在HF患者中没有（图4B）。在线性回归模型的多变量调整后，ln-SI和炎症评分在联合队列和HT亚组中的负相关仍然显著，但在HF或LVAD患者中不显著。

213名参与者的ln-SI与肠道微生物多样性之间的关系如图4C所示。在分析整个队列时，ln-SI与肠道微生物多样性呈中度正相关（r=0.28，p<0.01）。在每个亚组中都观察到这种显著的相关性（图4D）。在线性回归模型的多变量调整后，ln-SI和肠道微生物多样性之间的正相关在联合队列中仍然显著，但在单个队列中不显著。

200名参与者的ln-SI和唾液微生物多样性之间的关系如图4E所示。在整个队列中均呈中度正相关（r=0.24，p < 0.01）。这LVAD和HT亚组中观察到这种显著相关性，但在HF患者中没有（图4F）。在线性回归模型进行多变量调整后，ln-SI和唾液微生物多样性之间的正相关关系在联合队列中仍然显著，但在单个队列中不显著。

与SI相关的肠道上段和口腔分类群分别如图5A、B所示。多变量调整后，肠道菌群罗氏菌的存在（vs 不存在）与SI水平升高相关，这些发现也存在于HF和HT患者亚组中。此外，在检测到埃格特氏菌和克雷伯氏菌的患者中，SI水平有降低的趋势(无统计学意义)。口腔类群南氏普雷沃特菌和普雷沃特菌-7的存在与较高的SI水平相关，而乳酸杆菌和内氏放线菌的存在与较低的SI水平相关。对具有潜在AA合成功能的先验类群的分析没有得出任何显著的结果(数据未显示)。

心力衰竭的进展与SI的恶化、炎症水平的增加以及肠道和口腔微生物群的变化有关。严重的消化道（肠道和口腔）生态失调和炎症反应伴随着LVAD和HT后早期SI的进一步下降；这些变化在长期内可改善，但并不能改善症状性心衰。肠道微生物的多样性与炎症指标有关。肠道和口腔微生物多样性和个体类群与SI相关。

骨骼肌减少症在心衰患者中非常普遍，导致住院率和总死亡率的增加。SI是一种现成的骨骼肌质量生物标志物，已在包括危重患者、老年患者、肺和肾移植受者、糖尿病的和癌症患者在内的多个人群中得到验证。

我们的研究表明，随着心衰恶化，SI逐渐降低，代表心衰进展背景下骨骼肌质量损失。SI在LVAD或HT后1个月内达到最低点，可能反映了手术对脆弱的HF患者的额外伤害。在这些干预后6-12个月观察到SI的升高，但仅达到症状性心衰水平。骨骼肌减少症的恶化、心衰的进展和术后进一步加重的趋势与先前的研究一致。LVAD和HT后骨骼肌异常的不完全恢复也有报道，并与残余心肺储备减少的临床表现相一致。心衰患者肌肉萎缩的潜在机制是复杂的。它们与持续的炎症、氧化应激、能量代谢异常、线粒体功能障碍以及激素变化有关，并伴随着肌纤维从I型到II型的转变和肌肉萎缩。在心衰进展过程中，肠壁充血和心衰导致灌注不足背景下的肠道微生物组成的改变也被假设为心衰、炎症和骨骼肌减少症之间的机制联系。

观察到的HF、LVAD和HT患者与炎症和微生物多样性的关系与我们之前的报道一致，对SI观察到的镜像模式支持了炎症和消化道微生物群在骨骼肌减少症发展中的潜在作用。具体来说，与症状较轻的HF相比，症状重的HF患者 微生物多样性呈下降趋势（肠道比口腔更强）而炎症呈加重趋势，且在LVAD或HT后1个月时，肠道和口腔生物多样性显著下降、炎症反应加重。与在LVAD或HT后的3-12个月观察到的SI升高一致，炎症减轻、肠道和口腔微生物群增加。随着时间的推移，肠道多样性的改变似乎是由LVAD和HT后厚壁菌门的减少和变形菌门的富集驱动的，并随时间发展向在HF中观察到的菌群组成转变。虽然我们之前已经报道了肠道微生物群和炎症生物标志物的一些模式，这是第一个显示口腔微生物群一致模式的报告。在LVAD和HT后早期观察到的微生物群变化，当时患者仍在医院术后恢复，这与之前在危重患者中观察到的严重肠道和口腔生态失调的报道一致。

虽然我们目前的研究结果是横断面的，不能解决关系的时间性，但骨骼肌减少症可能受到肠道微生物组改变的影响。最近的动物模型已经显示了健康的肠道微生物群和骨骼肌（肠道-肌肉轴）之间的关系，并已经确定了SCFAs和炎症细胞因子是相关的介质。Ponziani等人报道，在肝硬化的背景下，肝硬化和骨骼肌减少症患者的甲烷短杆菌、普雷沃氏菌和阿克曼菌（通常被认为是促进健康的类群）水平下降，同时潜在致病菌和炎症细菌如埃格特菌和克雷伯氏菌过度繁殖。

据我们所知，观察到罗氏菌与SI升高相关（经过多变量调整和多重比较调整）是在HF、LVAD和HT患者中的首次报道。这一发现也与它作为SCFA生产者的功能以及之前的一些报道相一致，即该分类群通常与更健康的表型相关。值得注意的是，尽管先前的研究表明微生物AA生产者在骨骼肌减少症中起作用，但我们先验确定的已知AA代谢功能的类群中没有一个与SI相关。

我们对唾液微生物群的发现是非常新颖的，因为之前没有研究广泛研究过心衰患者的口腔微生物群或其与骨骼肌减少症的关系。我们观察到口腔微生物群的研究结果通常与肠道微生物群一样显著。尽管个别亚组的一些多变量调整结果可能因为低强度失去了统计学意义，但唾液微生物多样性指标的模式与肠道观察到的多样性模式一致（即，与症状较轻的HF患者相比，症状较重的HF以及术后早期患者的多样性降低，且与SI呈正相关）。然而，需要进一步的研究来阐明口腔微生物群在骨骼肌减少症中的潜在作用，因为这些类群的发现有些出乎意料。例如，两种普雷沃氏菌被观察到与较高的SI（较少的骨骼肌减少症）水平有关，尽管事实上有许多普雷沃氏菌属（包括南卡氏普雷沃氏菌）已被证实与口腔炎症有关，并在相关疾病表型中富集。相比之下，内氏放线菌的存在与较低的SI（更多的骨骼肌减少症）值有关，尽管在口腔和全身疾病的研究中，该分类群被视为与健康相关的菌群。鉴于大量文献将口腔微生物群与各种口腔外心脏代谢结果相联系，这些相互矛盾的发现值得关注。这种性质的结果可能是由于未对与这一独特患者群体的健康行为（如，随着时间变化的饮食、活动水平）、临床轨迹和/或药物治疗相关的时变混杂因素进行调整造成的。然而，值得进一步研究关于口腔微生物群、全身炎症和心脏代谢风险的更广泛的文献，以确定口腔微生物群在包括骨骼肌减少症在内的不良心衰结局中的潜在作用。

本研究存在一定的局限性。虽然该报告是迄今为止发表的最大的经验报告，前瞻性地收集了HF、LVAD和HT患者的血液、唾液和粪便样本，但由于是单中心经验，可能限制了研究结果的普遍性。我们没有对肌肉功能或质量进行正式的评估，且对SI和CT胸肌横截面积的相关性分析是在一个亚组患者中进行的。然而，在之前的一份关于肾移植患者的报告中，SI与使用DEXA扫描的肌肉质量评估相关（r=0.675，p<0.001）。我们无法解释饮食或其他行为变量，而饮食已被证明与微生物群指标有关，且可能与骨骼肌减少症有关。两组之间的药物使用有明显的差异。与预期的一样，HT患者坚持免疫抑制方案，我们观察到，IV级HF患者的HF药物使用分布不均匀，可能与耐受性降低有关。在LVAD或HT之后，我们的样本量随着时间的推移而显著减少，这一事实引起了人们对选择偏差的关注（即，最健康的患者更有可能在更多的时间点提供数据）；这种偏差的方向是不确定的。此外，我们研究结果的直接临床意义并不明显，但希望我们的工作将刺激该领域的进一步研究，并将继续突破界限，寻求针对消化道微生物群的新疗法。

总之，我们观察到随着HF疾病进展，SI呈下降趋势，在LVAD或HT治疗后SI水平改善，但仅接近症状较少的心衰患者。骨骼肌减少症指数与炎症以相似的方式共同变化，并与整体肠道和唾液微生物多样性显著相关，包括特定的类群组成变化。我们需要进行更大规模的前瞻性研究（观察性和介入性）来解决骨骼肌代谢、炎症和消化道微生物群之间的时间性关联。