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研究背景
结核病（tuberculosis，TB）是严重危害人类健康的重大传染性疾病之一，如何有效地预防和控制结核病是我国乃至全球面临的一个重大公共卫生问题。结核病患者是结核病的主要传染源，所以结核病患者的早期、快速诊断是切断传染源、保护易感人群进而防控结核病的强有力手段。当前结核病实验室的诊断方法主要涉及到细菌学、免疫学、分子生物学和病理学等研究领域，这些诊断方法各有优缺点，单一的技术或多或少都存在局限性，所以主流方向是将多种技术联合使用，从而提高结核病的诊断效率；此外，研发新技术是改善目前结核病诊断方法相对落后的重要方向。因此，本文的研究宗旨就是开发一种集快速、简便、高灵敏度和特异度于一体的新型结核病诊断技术，也就是重组酶介导链替换核酸扩增（Recombinase-aid amplification，RAA）技术联合CRISPR-Cas13a系统（命名为RAA-CRISPR技术）用于高灵敏检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），为结核病的新诊断技术研发提供重要的参考。
研究内容
1. RAA-CRISPR-MTB检测方法的建立：以预处理的样品作为模板，经RAA等温扩增后体系内获得大量靶序列（MTB IS6110），并且模板经特异性的引物扩增后在其5’端引入一段T7转录序列；随后，在检测阶段的同一个体系中，RAA扩增产物先经T7 RNA聚合酶转录成单链RNA，然后目标RNA被特异性的crRNA识别并激活Cas13a蛋白，触发Cas13a蛋白的侧切割效应，体系中的报告RNA被裂解并释放出荧光报告基团分子，在适当波长的光激发下发出绿色信号，最终被仪器检测并收集。
2. 利用模拟MTB质粒检测RAA联合CRISPR-Cas13a技术的灵敏度：利用RAA联合CRISPR-Cas13a技术检测不同浓度的质粒模板，3×102 copies/μl、5×102 copies/μl和1×103 copies/μl的质粒模板可检测到，1 × 102 copies/μl的质粒模板检测不到（图2b）。RAA联合CRISPR-Cas13a技术检测模拟MTB质粒的灵敏度高达1 copy/μl（图2c、2d）。
3. 利用标准菌株H37Rv检测RAA联合CRISPR-Cas13a技术的灵敏度：RAA联合CRISPR-Cas13a技术检测标准菌株H37Rv的灵敏度为10 copies/μl（图2e、2f）
图2 利用RAA联合CRISPR-Cas13a技术检测模拟MTB质粒
(a) 含待检序列的重组质粒pUC57-6110示意图;（b）琼脂糖凝胶电泳检测模拟MTB质粒的RAA扩增产物;（c）利用RAA联合CRISPR-Cas13a技术检测不同浓度的质粒模板;（d）第60个循环时检测各浓度质粒荧光信号值的柱状图;（e）利用RAA联合CRISPR-Cas13a技术检测不同浓度的H37Rv;（f）第60个循环时检测各H37Rv菌株荧光信号值的柱状图
4. RAA联合CRISPR-Cas13a检测MTB的特异性分析：用该方法检测非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）未得到阳性结果（图3a、3b）。
图3 RAA-CRISPR-Cas13a检测各菌株DNA的特异性分析
(a)图为琼脂糖凝胶电泳检测各菌株DNA的扩增产物;(b)图为荧光定量PCR仪检测各菌株DNA荧光信号值变化的趋势图; 1：H37Rv; 2：堪萨斯分枝杆菌; 3：戈登分枝杆菌; 4：鸟分枝杆菌; 5：胞内分枝杆菌; 6：脓肿分枝杆菌; 7：偶发分枝杆菌
5. RAA联合CRISPR-Cas13a检测临床样本MTB：本部分课题研究共纳入151例疑似结核病患者，经过临床诊断确定有106例结核病患者和45例其他肺部疾病患者。在106 例结核病患者中， 涂片镜检阳性29例 (27%, 29/106), 培养阳性47 例 (44%, 47/106), GeneXpert 阳性64 例 (60%, 64/106), RAA联合CRISPR-Cas13a检测阳性73 例 (69%, 73/106) (图 4a)。同时，RAA联合CRISPR-Cas13a检测56例涂阴培阴患者标本，检测出阳性30例，敏感度为 54% (30/56), 高于Gene Xpert 方法 (29%, 16/56) （图4b)。在特异度方面，45例非结核病患者中， RAA-CRISPR 结果无假阳性，特异度为 100% 。
图4 涂片、培养、GeneXpert和 RAA-CRISPR检测临床标本MTB灵敏度和特异度的比较
(a) 106例结核病患者中，四种方法检测敏感度; (b) 56例涂阴培阴患者中，RAA-CRISPR 和GeneXpert 检测的敏感度；McNemar’s test, ** P < 0.01, *** P < 0.001
意义与展望
基于RAA等温扩增与CRISPR-Cas13a系统的结核分枝杆菌检测方法的灵敏度（68.9%）略高于GeneXpert MTB/RIF检测（60.4%），显著高于痰涂片镜检（27.4%）和分枝杆菌培养（44.3%），且检测的特异度良好。该方法在菌阳结核病患者中的灵敏度与GeneXpert MTB/RIF分子检测相当，但是在菌阴人群的诊断中具有显著的优势。经过临床痰标本的进一步验证与评估，RAA联合CRISPR-Cas13a系统的检测方法在临床诊断中具有较高的应用价值。此外，基于上述研究，向更加便捷的试纸条转化，在临床诊断中具有良好的研发前景。
注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社的观点。
编辑：王 然
审校：郭 萌
发布日期：2024-09-19
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