【快报】LILRB1-HLA-G轴诱导结核病患者自然杀伤细胞功能耗竭

1. TB患者外周血NK细胞功能改变：我们首先分析了HC组、LTBI组和ATB组人群外周血免疫细胞数量，结果发现：ATB组外周血中NK细胞和T细胞占比减少，而单核细胞占比增加。同时，ATB组外周血中B细胞占比较LTBI组降低。考虑到ATB患者外周血中NK细胞占比下降最为明显，且NK免疫功能障碍常与TB等感染性疾病进展密切相关，我们进一步对三类人群的外周血NK细胞进行了转录组分析，发现ATB患者的NK细胞中炎症反应（如Toll样受体、NOD样受体和TB相关信号通路）和凋亡基因表达均上调，而磷酸肌醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-AKT和RAP1信号通路及与NK细胞杀伤活性相关基因的表达均下调。接下来，我们构建了NK细胞与MTB感染的单核细胞来源的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages，MDMs）的共培养系统以检测不同人群来源的NK细胞的抗MTB感染功能，结果显示，ATB组NK细胞中IFN-γ和TNF-α表达水平及凋亡水平均明显高于HC组和LTBI组，而NK细胞表面表达CD107a（NK细胞脱颗粒的标志，显示细胞杀伤活性）水平明显低于HC和LTBI组。一致的是，我们还发现ATB组NK细胞杀伤MTB感染的MDMs进而控制MTB感染的能力显著减弱。以上结果表明，ATB患者的NK细胞表现出一种免疫耗竭的表型，其特征主要包括细胞杀伤功能下降、细胞凋亡水平升高，以及对MTB感染细胞的杀伤能力显著减弱。具体见图1。

注 A：HC、LTBI和ATB组志愿者外周血中各类免疫细胞占比。B：ATB与HC（左）或ATB与LTBI（右）外周血NK细胞转录谱的基因集富集分析（GSEA）。C：KEGG分析HC、LTBI和ATB组NK细胞的信号通路水平差异。D～F：HC、LTBI和ATB组NK细胞与MTB感染的MDMs共孵育后，NK细胞表达IFN-γ（D）、TNF-α（E）或者CD107a（F）水平差异。G：HC、LTBI和ATB组NK细胞与MTB感染的MDMs共孵育后，NK细胞凋亡水平差异。H：HC、LTBI和ATB组NK细胞与MTB感染的MDMs共孵育后，MTB的CFU差异

图1 ATB患者中NK细胞抗MTB免疫功能下降。

2. TB患者存在高表达抑制性受体LILRB1的特异性NK细胞亚群：NK细胞的免疫功能由细胞表面激活性和抑制性受体所调控。我们通过CyTOF对HC、LTBI和ATB组NK细胞的39种免疫标记物的表达水平进行分析，并基于此将NK细胞分为19个NK细胞亚群，即：cluster (C) 1-19，其中，C5亚群主要存在于ATB组。进一步分析发现：NK细胞C5亚群中大多数激活性受体的表达水平均降低（如NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44和NKp46），而抑制性受体LILRB1的表达水平显著升高。与该免疫特征一致，NK细胞C5亚群中颗粒酶B （granzyme B，GZMB）和穿孔素（perforin，PRF1）的表达水平均下降，提示其免疫杀伤功能减弱。该结果与图1中NK细胞转录组分析提示的免疫特征一致。综上，ATB患者存在一类特异性NK细胞亚群，其高表达抑制性受体LILRB1。具体见图2。

注 A：基于CyTOF数据的t-SNE分析显示HC、LTBI和ATB组NK细胞可分为19个细胞亚群C1-C19，C5用虚线圈表示。B：HC、LTBI和ATB组总NK细胞中C5亚群所占百分比。C：HC、LTBI和ATB组每种NK细胞亚群所占的百分比及免疫标志物表达水平热图分析。柱状图（左）显示了C1-C19亚群在HC（蓝色）、LTBI（橙色）或ATB（绿色）组总NK细胞中的占比。热图（右）显示了C1-C19亚群每种免疫标志物的表达水平。C5亚群和抑制受体LILRB1以红色突出显示。D：LILRB1在各NK细胞亚群中的表达水平。C5亚群用红色表示。E：HC、LTBI和ATB组NK细胞C5亚群中LILRB1的表达水平。F：HC、LTBI和ATB组中LILRB1、GZMB、PRF1、IFN-γ、TNF-α的t-SNE分析，C5用虚线圈表示

图2 TB患者特异的NK细胞亚群高表达抑制性受体LILRB1

3. 抑制性受体LILRB1驱动TB患者NK细胞耗竭：CyTOF数据表明，NK细胞中LILRB1表达水平与GZMB和PRF1的表达水平均呈负相关，而与IFN-γ和TNF-α的表达水平均呈正相关。另外，使用LILRB1过表达的NK细胞与MTB感染的MDMs共培养时，NK细胞表面CD107a表达水平显著下降，但是IFN-γ或TNF-α表达水平变化不大，同时NK细胞GZMB和PRF1的分泌量减少，细胞凋亡比例增加，最终导致抗MTB能力减弱。进一步对ATB患者肺组织中LILRB1的表达情况进行检测，结果发现肉芽肿中的循环NK细胞（CD56⁺CD69^-或CD56⁺CD103^-）和肺组织中的驻留NK细胞（CD56⁺CD69⁺或CD56⁺CD103⁺）都表现为LILRB1高表达。我们还注意到，这些NK细胞在坏死性肉芽肿中的LILRB1表达相对高于非坏死性肉芽肿。这些数据提示在MTB感染下LILRB1是一个潜在的关键免疫可控点分子，其上调代表了NK细胞的免疫功能耗竭表型。具体见图3。

注 A：基于CyTOF数据的LILRB1与GZMB、PRF1、IFN-γ、TNF-α等标志物表达的相关性分析。B～D：CD107⁺（B），INF-γ⁺（C），或者TNF-α⁺（D）NK细胞在NK细胞中所占的百分比。E，F：MDMs-NK细胞共培养上清中GZMB（E）和PRF1（F）的水平。G：NK细胞中发生细胞凋亡的NK细胞所占的百分比。H：MDMs-NK细胞共培养下MTB的存活率。I：ATB患者非坏死或坏死肉芽肿或肉芽肿病变附近健康对照组织的人肺切片的组织学和免疫荧光分析。左图为苏木精和伊红（HE）染色的代表性图像（比例尺，200 μm）。右图为含有LILRB1（蓝色）、CD56（绿色）、CD69或CD103（红色）抗体的细胞的代表性图像（比例尺，10 μm）。细胞核用DAPI染色（灰色）。J，K：健康或非坏死肉芽肿或坏死肉芽肿中CD56⁺CD69⁺或者CD56⁺CD69^-NK细胞（J）以及CD56⁺CD103⁺或者CD56⁺CD103^-NK细胞（K）中LIRB1表达的定量分析

图3 LILRB1过表达抑制NK细胞抗MTB免疫功能

4. MTB感染状态下HLA-G诱导LILRB1依赖的NK细胞耗竭：我们进一步分析了LILRB1高表达的NK细胞在TB感染状态下的特异性，发现ATB组的NK细胞仅高表达抑制性受体LILRB1，而不高表达另一种抑制性受体TIGIT（T-cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains）。此外，LILRB1仅在ATB患者的NK细胞中高表达，而不在 T细胞、B细胞和单核细胞中高表达。上述结果提示LILRB1在NK细胞抗MTB感染应答中具有独特调控作用。

我们进一步深入探究了MTB感染条件下NK细胞中LILRB1高表达及激活的具体机制。非经典MHC I类分子HLA-G是LILRB1的经典配体，且与TB发病机制相关。我们在ATB患者的血清中检测到可溶性的HLA-G水平升高，且HLA-G处理可显著提升NK细胞表面LILRB1的表达。此外，感染MTB的MDMs显示细胞膜表面HLA-G和上清中可溶性HLA-G的含量均增加。同样的，与MTB感染的MDMs共培养时，HC来源的NK细胞表面的LILRB1表达增加，该效果在抗HLA-G中和单克隆抗体（87G mAb）处理时消失。此外，NK-MDMs共培养过程中，HLA-G中和抗体显著增加NK细胞CD107a的表达和GZMB和PRF1的产生，同时减少了NK细胞的凋亡。但是在不表达LILRB1的NK细胞对照组中，HLA-G单抗处理对NK细胞功能影响不明显。同样的，在NK-MDMs共培养过程中，LILRB1单克隆抗体处理同样可以显著提升NK细胞CD107a表达和GZMB和PRF1的产生，同时细胞凋亡减少，抗MTB能力增强。综上，MTB感染促进巨噬细胞HLA-G的转录及表达，进而诱导NK细胞高表达抑制性受体LILRB1来诱导NK细胞耗竭。具体见图4。

注 A、B：HC、LTBI以及ATB组外周血中LILRB1⁺（A）或TIGIT⁺（B）NK细胞的数量。C：HC、LTBI和ATB组血清可溶性HLA-G水平。D：用0～5 μg/ml HLA-G处理NK细胞3 d后细胞中LILRB1⁺细胞的百分比。E：在与MTB-Mφ或者对照组MDMs（Ctrl-Mφ）共培养3 d，同时用anti-HLA-G（87G）mAb或者IgG对照组处理后的LILRB1⁺ NK细胞的比例。F：CD107a⁺ NK细胞占NK细胞总数的百分比。G，H：MDMs-NK细胞共培养上清中GZMB（G）和PRF1（H）的水平。I：发生细胞凋亡的NK细胞占NK细胞总数的百分比。J：在MDMs-NK细胞共培养体系中MTB的存活情况。K：用抗LILRB1（GHI/75）mAb或IgG对照处理过表达LILRB1的HEK293T细胞后，HLA-G结合到细胞表面的情况，包括代表性直方图（左）和定量图（右）。L：CD107a⁺ NK细胞占NK细胞总量的百分比。M、N：在MDMs-NK细胞共培养上清中GZMB（M）和PRF1（N）的水平。O：发生细胞凋亡的NK细胞占NK细胞总量的比例。P：MDMs-NK细胞共培养体系中MTB的存活情况

图4 MTB感染条件下LILRB-HLA-G轴驱动NK细胞耗竭

5. LILRB1-HLA-G轴通过SHP1/2抑制MAPK信号通路进而诱导NK细胞耗竭：通过对HC、LTBI和ATB三类人群来源的NK细胞的转录组数据进行综合分析，我们发现ATB患者NK细胞中参与细胞凋亡和细胞杀伤活性的关键调节因子蛋白C-ets-1（ETS1）与ATB表现出最强的负相关性。此外，ATB患者来源的NK细胞的转录特征还表现为RAP1和PI3K信号通路抑制，这两个信号通路都介导下游MAPK信号通路（包括MEK1/2和ERK1/2）的激活，最终导致ETS1激活。RAP1和PI3K信号通路的调控涉及Src同源结构域蛋白1/2（Src homology domain 2-containing protein 1/2，SHP1/2），SHP1/2可被包括LILRB1在内的含免疫受体酪氨酸基抑制性基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM）受体募集并磷酸化，进而被激活并抑制NK细胞免疫功能。基于此，我们推测，LILRB1-HLA-G相互作用可通过SHP1/2抑制MEK1/ 2-ERK1/2-ETS1 MAPK信号轴，从而抑制ATB患者NK细胞杀伤活性并促进细胞凋亡。进一步的实验结果表明，ATB组NK细胞p-B-raf（RAP1驱动MEK1/2磷酸化的效应蛋白）、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-ETS1水平均较低，但LILRB1、p-SHP1/2和cleaved caspase-3（促凋亡caspase）水平均较高。使用甲磺酸拉达菲尼（dabrafenib mesylate，DM）和SCH772984分别特异性抑制B-raf和ERK1/2后，LILRB1封闭性抗体促进NK细胞CD107a表达且抑制NK细胞凋亡的功能消失。因此，MTB感染条件下，LILRB1-HLA-G轴通过MEK1/2-ERK1/2-ETS1信号通路抑制NK细胞杀伤活性抑制并促进NK细胞凋亡。此外，使用TPI-1和SHP099分别特异性抑制SHP1和SHP2，或使用NSC87877同时抑制SHP1/2，均可促进ATB患者来源的NK细胞中MEK1/2-ERK1/2-ETS1信号通路的激活，相应地增加CD107a的表达，并减少NK细胞的凋亡。因此，SHP1和SHP2均参与介导HLA-G和LILRB1相互作用后NK细胞的细胞杀伤活性抑制。我们进一步通过构建MDMs-NK共培养体系对上述信号通路介导的NK细胞杀伤功能的调控作用进行验证，发现LILRB1封闭性抗体可显著提升ATB患者NK细胞杀伤功能及NK细胞凋亡减少，抗MTB能力增强，而在ERK1/2抑制剂SCH772984处理条件下，LILRB1封闭性抗体的功能消失，而SHP1/2抑制剂NSC87877单用或联合LILRB1阻断治疗可提升NK细胞的抗MTB能力，且两者作用效果无显著差异。综上，LILRB1-HLA-G轴通过SHP1/2抑制MEK1/2-ERK1/2-ETS1 MAPK信号通路，从而导致NK细胞杀伤活性降低和凋亡增加。具体见图5。

注  A：从ATB患者中富集到的与NK细胞转录特征相关的转录因子。B：LILRB1-HLA-G相互作用介导的NK细胞功能调节的示意模型。C：MDMs-NK共培养24 h后NK细胞相关蛋白表达的免疫印迹（C）以及定量（D）分析。E，F：CD107a⁺（E）或凋亡（F）NK细胞占NK细胞总数的百分比。G：MDMs-NK细胞共培养体系中MTB的存活情况

图5  LILRB1-HLA-G相互作用通过SHP1/2抑制MAPK信号通路进而诱导NK细胞耗竭

6. 阻断HLA-G-LILRB1互作可提升TB特异的功能耗竭的NK细胞亚群的抗MTB功能：考虑到LILRB1主要在ATB特异的C5细胞亚群中高表达，其免疫特征是CD56、CD4和CD14共表达，我们随后收集了ATB患者的CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺细胞群，并进一步验证通过LILRB1封闭性抗体阻断HLA-G-LILRB1互作是否可以增强该细胞亚群的抗MTB功能。结果发现，与CyTOF数据一致，大多数CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺细胞高表达LILRB1，且该亚群在ATB患者外周血中NK细胞中占比较大。接下来将该细胞亚群与MTB感染的MDMs共培养发现，当在共培养系统中加入LILRB1封闭性抗体时，CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺细胞对MTB感染MDMs的杀伤活性显著提升。上述结果提示该亚群尽管表达单核细胞标志物CD14，但其属于NK细胞的独特细胞亚群，该细胞亚群可通过LILRB1抗体处理来提升其杀伤活性。为了证实这一论点，我们还记录了CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ 细胞直接杀死MTB感染MDMs的动态过程，该现象在LILRB1封闭性抗体处理下更易观察到。同样的，我们还确认了LILRB1封闭性抗体处理可提升该细胞亚群CD107a、GZMB和PRF1的表达水平，减少该亚群的细胞凋亡，最终增强其抗MTB活性。上述数据表明，破坏HLA-G-LILRB1互作可增强ATB患者特异的功能耗竭的NK细胞亚群的抗MTB功能。具体见图6。

注 A、B：免疫荧光检测CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ 细胞（效应细胞）对MTB感染的MDMs（MTB-Mφ）的颗粒极化（A）和细胞毒活性（B）的代表性图像（左）和定量图（右）。细菌感染前用Alexa Fluor 488琥珀酰亚胺酯（绿色）染色。CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ 细胞用Hoechst染色（蓝色），LysoTracker标记（红色，白色箭头）来监测裂解性颗粒向靶细胞的极化，这是NK细胞在脱颗粒过程中的一个特征。MDMs的裂解情况用DRAQ7的吸收所确定（红色、黑色箭头）。比例尺：10 μm。C：MTB-Mφ钙黄蛋白释放的延时分析（左）和定量分析（右）。CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ 细胞与MTB-Mφ共培养12 h，然后监测2 h。感染前用Alexa Fluor 594琥珀酰亚胺酯（红色）染色。MDMs用钙黄蛋白（绿色）预染色，钙黄蛋白是从效应细胞裂解的死细胞中释放出来的细胞活力指标（箭头）。比例尺：10 μm。D–G：在全部CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ 细胞中，CD107a⁺（D）、GZMB⁺（E）、PRF1⁺（F）和凋亡（G）细胞的比例。CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ 细胞在抗LILRB1（GHI/75）单抗或IgG对照下，以3:1的比例与或不与MTB-Mφ共培养24 h。H：MDMs^- CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ NK效应细胞共培养体系中MTB存活情况。MDMs感染MTB，然后与CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ NK效应细胞共培养24 h，培养方法与（D–G）相同。

图6 LILRB1抗体阻断增强ATB患者CD3^-CD56⁺CD4⁺CD14⁺ NK细胞亚群的抗MTB功能

7. LILRB1封闭性抗体提升免疫系统人源化小鼠的抗MTB免疫功能：为了在小鼠水平检测LILRB1抗体阻断对MTB感染的治疗潜力，我们首先制备了抗LILRB1的多克隆抗体（pAb），检测结果显示该抗体可以有效阻断HLA-G与细胞表面LILRB1的结合，且在促进NK细胞CD107a表达和增强NK细胞抗MTB能力方面与细胞水平使用的LILRB1单克隆抗体GHI/75效果相当。随后我们分别获取了HC、LTBI和ATB三类人群的PBMCs，并将其通过尾静脉注射到NOD/ShiLtJGpt-Prkd_cem26Cd52Il2rg_em26Cd22/Gpt（NCG）小鼠体内建立免疫系统人源化小鼠。进一步使小鼠感染MTB，4周后收取小鼠组织进行分析发现，与来源于HC或LTBI的PBMCs移植的小鼠相比，移植了ATB患者来源的PBMCs的小鼠肺部表现出更高的炎症浸润及更重的细菌负担等，而抗LILRB1 pAb处理后可显著减少炎症浸润及细菌负担。这些数据表明，LILRB1抗体阻断处理可恢复移植了ATB患者PBMCs的免疫人源化小鼠的宿主抗MTB免疫功能。此外，ERK1/2的抑制剂SCH772984处理可消除LILRB1抗体对宿主抗MTB免疫功能的逆转效果。综上，LILRB1抗体阻断以ERK1/2 MAPK信号依赖的方式逆转免疫系统人源化小鼠的宿主抗MTB免疫。具体见图7。

注  A：实验设计示意图。将HC、LTBI或ATB来源的PBMCs移植到NCG小鼠体内。2周后，小鼠经雾化（~100 CFUs）感染MTB 4周，同时每3天给予PBS（对照）、IgG或抗LILRB1 pAb处理，每2天给予玉米油（对照）或SCH772984处理。B：肺切片HE染色、抗酸染色和免疫荧光染色的代表性图像（上）和定量图（下）。比例尺：1 mm，10 μm，10 μm。免疫染色：NK细胞用抗人CD56抗体染色（红色），凋亡细胞用TUNEL染色（绿色），细胞核用DAPI染色（蓝色）。黑色箭头表示肉芽肿样炎性病变。黑色箭头表示MTB。白色箭头表示TUNEL⁺ NK细胞。C，D：肺组织GZMB（C）或PRF1（D）的酶联免疫吸附试验（ELISA）。E，F：小鼠肺（E）或脾（F）组织的细菌CFU

图7 阻断LILRB1可恢复免疫系统人源化小鼠的抗MTB免疫功能

8. LILRB1封闭性抗体以NK细胞依赖的方式增强宿主抗MTB免疫：为了证实LILRB1抗体阻断主要通过靶向NK细胞发挥功能，我们随后建立了使用ATB患者来源的PBMCs（去除或不去除NK细胞）移植的免疫系统人源化小鼠。我们发现LILRB1 pAb抗体阻断治疗可有效减轻MTB感染小鼠肺部的炎症浸润和细胞凋亡水平，同时提升肺NK细胞的杀伤活性，最终提升抗MTB免疫水平，且上述功能均依赖于NK细胞。综上，LILRB1抗体阻断治疗可恢复ATB患者NK细胞的免疫功能来增强宿主抗MTB免疫。具体见图8。

注 A：实验设计示意图。将ATB患者的对照PBMCs或NK细胞去除（ΔNK）的 PBMCs移植到NCG小鼠中。2周后，小鼠通过雾化（~100 CFUs）感染MTB，每3天给予IgG或LILRB1 pAb治疗，持续4周。B，C：肺切片H-E染色（B）和免疫荧光染色（C）的代表性图像（左）和定量（右）。比例尺：1 mm，10 μm。免疫染色：NK细胞用抗人CD56抗体染色（红色），凋亡细胞用TUNEL染色（绿色），细胞核用DAPI染色（蓝色）。黑色箭头表示肉芽肿样炎性病变。白色箭头表示TUNEL⁺ NK细胞。D，E：对肺组织GZMB （D）或PRF1 （E）的ELISA检测。F，G：小鼠肺（F）或脾（G）组织的细菌CFU

图8 阻断LILRB1恢复NK细胞依赖的免疫系统人源化小鼠的抗MTB免疫功能