国自然申请|研究“蛋白与靶基因DNA互作”的几种经典技术(上)

学术   2024-11-04 18:31   上海  

继“蛋白-蛋白”、“蛋白-RNA”、“小分子药物-蛋白”以后:

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本期我们来梳理“蛋白与靶基因DNA”结合这个主题的方法,由于内容比较多,今天先发方法梳理前的说明,此为(上)。

同样的,与其它三期类似,在介绍方法之前我先做一些说明:

1.大家关注蛋白与DNA结合,很多时候角度是在转录(调控)因子与靶基因DNA的结合上,即我们想通过蛋白与DNA的结合实验证明的主题是“转录(调控)因子通过与靶基因DNA结合从而调控靶基因RNA的转录”。当然DNA与蛋白的结合并不局限于这个主题,比如“受损的线粒体DNAmtDNA)就可被cGAS识别并激活下游STING信号通路”,并参与炎症活化等过程;另外能够识别发挥转录调控作用的也并不局限于经典的“转录(调控)因子”这一类,比如先前Cell主刊上报道的“RNA结合蛋白也可广泛参与基因的转录调控”:

2. 基因的转录调控是一个过程,因此就会分为不同的阶段和步骤,因此有一些机制做的比较详细的研究就会说蛋白对基因转录调控的具体影响,比如转录起始 (Transcription Initiation)、转录延伸(延长,Transcription Elongation)、还是转录终止(Transcription Termination),而我们平时说转录因子对靶基因的转录激活多数指的是转录起始,但也有很多蛋白影响的是转录延伸和转录终止:

3. 通常我们关注的转录因子与靶基因DNA结合后调控其转录的过程,大家关注的一般是基因的启动子区域(一般TSS下游200TSS上游1.5K-2K左右),其实有很多蛋白对靶基因DNA的结合是在基因Body

4. 研究转录(调控)因子对靶基因mRNA的转录调控一般分为两个主题:a)作为蛋白的转录因子与靶基因DNA序列的结合;b)转录因子结合后对靶基因转录活性的影响。因此在后续的方法中有一些是验证蛋白(转录因子)与DNA结合的(比如大家比较熟悉的ChIP-Seq/PCRDNA EMSA实验和DNA pulldown实验),也有一些是验证蛋白(转录因子)对靶基因mRNA的转录调控活性的(比如荧光素酶报告基因实验);

5. 与蛋白-蛋白结合、蛋白-RNA结合一样,要验证转录因子对靶基因的调控需要几个方法结合起来证明单独的某一个实验几乎不可能说明“转录因子对靶基因mRNA直接转录激活”;

6. 转录调控的组成性调控与细胞组织的特异性:由于很多必需(Essential)基因需要在各细胞中表达,因此有一些转录因子是广谱性和强制激活的大家可以理解为细胞存活必需品);但是还有一些转录因子是环境刺激响应、细胞组织特异性的大家可以理解为调味品),比如大家很熟悉的缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF1α)

先说到这里吧谢谢!

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