国自然申请|研究“蛋白与DNA互作”的几种经典技术以及注意事项(下)

学术   2024-11-06 13:00   上海  

承接上期我们介绍了在研究蛋白与DNA互作的注意事项(国自然申请|研究“蛋白与靶基因DNA互作”的几种经典技术(上))后,我们把研究方法汇总一下。如前所述,在研究蛋白与DNA互作的方法中,大致有两个角度:确定蛋白与DNA结合,以及确定转录调控作用两个。

  • 一、ChIP -Seq/PCR

染色质免疫沉淀测序(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP))是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的高通量测序技术。它可以用来识别特定蛋白质(通常是转录因子或组蛋白修饰)在基因组上的结合位点。

大致步骤:

1)免疫沉淀:首先,细胞被固定,通常是通过甲醛交联,这样可以保持蛋白质和DNA之间的相互作用。然后,使用针对特定蛋白质的抗体进行免疫沉淀,将目标蛋白质及其结合的DNA一起沉淀下来。

2DNA片段化:交联被逆转后,DNA被酶切或物理方法打断成小片段,以便进行测序。

3)测序(Sequencing:沉淀下来的DNA片段被纯化并进行测序。这可以是短读长测序也可以是长读长测序,取决于实验设计和使用的平台。

4)数据分析:测序得到的短序列(reads)被比对到参考基因组上,以确定蛋白质结合的精确位置。通过分析reads的分布,可以识别出富集的区域,即蛋白质结合的位点。

说明:ChIP-Seq是大家最为熟悉的筛选与蛋白结合DNA序列的组学方法,而ChIP后进行PCR则是直接的验证方法。在国自然项目或者大家研究中,主要用于筛选转录因子蛋白的靶基因,是技术必选项了。当然,ChIP-Seq/PCR也有一些注意事项:比如aChIP-Seq类似于RIP-Seq,也是没法精确到具体结合位点的(理论上说蛋白与DNA结合也只是一个位点);b)实验分组的设置,一般情况下除了ChIP组以外,还需要InputIgG组;c)通过PCR验证ChIP-Seq结果时,也需要设计多对引物:在结合峰位置设计2-3对引物,而非结合峰位置也需要设计引物,从而进一步确认结合峰的位置。

二、DNA pull-down实验

DNA pull-down实验基于蛋白质与特定DNA序列之间的亲和性,通过特定的DNA探针捕获与其结合的蛋白质,实现对蛋白质-DNA复合物的富集和分析。

大致实验步骤:

1DNA探针制备:首先合成或制备含有目标DNA序列的探针,这些探针可以是寡核苷酸或DNA片段,并通过化学合成或PCR扩增等方法获得。

2DNA探针修饰:在DNA探针的末端引入标记物,如生物素或荧光染料,以便实验操作和检测。

3)蛋白质提取:从细胞或组织中提取目标蛋白质样品,这可以是细胞裂解物、组织提取物或纯化的蛋白质。

4DNA探针固定:将修饰后的DNA探针固定在固相载体上,常用的载体包括琼脂糖珠或磁珠。

5DNA-蛋白质结合:将蛋白质样品与固定的DNA探针混合孵育,使蛋白质与DNA探针发生特异性结合。

6)洗涤:通过多次洗涤去除未结合的蛋白质,以减少非特异性结合,提高实验的特异性和准确性。

7)蛋白质检测与分析:使用Western blot、质谱分析等方法对与DNA探针结合的蛋白质进行检测和分析,以鉴定特定的蛋白质-DNA相互作用。

说明:DNA pull-down实验与ChIP-Seq实验是镜像实验,关系类似于RNA pulldownRIP-Seq的关系,因此DNA pulldown是通过DNA探针来找(筛选)蛋白的。所以大家如果知道了靶基因,想通过实验方法筛选可能调控靶基因转录的蛋白,就可以通过这个方法筛选。同样的道理,在DNA pulldown实验中也需要设计对照组,以排除非特异性结合;当然也可以通过蛋白条带来比较各组的差异,并对特异性条带通过质谱鉴定或者WB验证。

三、DNA EMSA实验

DNA EMSAElectrophoretic Mobility Shift Assay,电泳迁移率变动分析)实验是一种用于研究蛋白质与DNA之间相互作用的技术。EMSA基于DNA-蛋白质复合物在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中的不同迁移率。当转录因子与特定的DNA结合后,其在PAGE中的迁移率将小于未结合核蛋白转录因子的DNA,从而检测到与DNARNA结合的蛋白转录或调节因子。

大致步骤:

1)设计特异性探针:根据研究目的设计特异性探针实验组以及非特异性对照组。

2)混合孵育:将设计好的探针与样本蛋白混合孵育,形成蛋白-探针复合物。

3)聚丙烯酰胺凝胶电泳:进行电泳,并将蛋白-探针复合物转移到膜上。

4)检测与成像:在膜上检测、曝光成像,观察蛋白-探针复合物的位置,从而判断是否有蛋白与目标探针有互作。

说明:DNA EMSA实验也是验证DNA与蛋白结合的经典方法,先前我们说验证蛋白与RNA结合的时候说过RNA EMSA,也就是说不管是DNA还是RNA,都可以通过EMSA实验进行验证。虽然这个技术在很多国自然本子里面不出现,但确实是很简单、但很重要的证明蛋白与DNA结合的直接技术,像ChIP-SeqDNA pulldown是不能直接证明结合的;而且这个技术如果用好了,还能证明B蛋白在A转录因子结合靶基因DNA的必要桥梁作用。

四、(双)荧光素酶报告基因实验

荧光素酶报告基因实验是研究转录因子对靶基因DNA转录调控活性的经典实验之一。荧光素酶报告基因实验利用荧光素酶基因作为报告基因,通过测量其活性来反映转录因子与靶基因启动子区域的相互作用。

大致步骤:

1构建报告基因载体:将含有靶基因启动子序列的DNA片段插入到荧光素酶基因的上游,构建报告基因质粒。

2转染细胞:将报告基因质粒和转录因子表达质粒共转染入目标细胞中。

3刺激处理:根据实验需要,对转染后的细胞进行特定的刺激或处理。

4荧光素酶活性测定:在刺激处理后,向细胞中添加荧光素酶底物,检测荧光素酶活性。

5数据分析:通过比较荧光素酶活性的变化,分析转录因子对靶基因DNA结合的影响。

说明:荧光素酶报告基因实验应用场景很多,可以用来验证转录因子调控靶基因转录活性,也可以用在很多其它的场景中,比如miRNA对靶基因mRNA的调控等;而且一般做的是双荧光素酶报告基因(做背景校正)。还有一点很重要的:在研究靶基因转录活性上,荧光素酶报告基因本质是转录活性的增加,而并不局限在转录因子对靶基因的作用上,举个相对极端一些的例子:比如我们可以通过荧光素酶报告基因实验发现miRNA-1能增加基因A的转录活性(这里不是miRNA与靶基因的荧光素酶,而是启动子的荧光素酶),其实就可以说miRNA-1转录激活基因A的,至于是不是直接转录激活,即miRNA-1作为NamiRNA转录激活基因A,还是miRNA-1通过经典方式抑制(直接)靶基因TmRNA降解或者mRNA翻译抑制)从而导致靶基因T转录激活基因A,就是后续要验证的具体机制了

总结:本期总结的4个技术都是非常经典和常见的技术,稍微新一些的Cut-tag这些技术都没有说,就个人观点来说:技术是为了解决科学问题,只有对某个技术的优劣势很了解,才能对技术呈现的结果有很好的解读,就像WB这样简单的技术,不同人跑出来的条带差别还是很大;另外,当我们想解决某个科学问题但是没有很好的技术方法时,就可以基于对技术的了解,改造和开发新技术。

最后预告一下本周六直播主题:“介绍一下我们团队,并进行国自然或者科研答疑”。

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