“细胞衰老”是大家非常关注的科研热点之一，今天我们介绍的这项研究是重庆医科大学团队发表在Nature Communications期刊上的研究。之所以介绍这篇NC的研究，是因为这类研究代表了从小分子药物、代谢物、肠道菌群等角度深入系统的开展研究的一个策略（一般这类研究都能发在10+的期刊上），也是大家申请国自然项目的时候可参考的模板。
下面我们看一下这项研究主要的发现：
1）研究关注的切入点是从“药食同源”的蜂王浆的成分中链脂肪酸10-HDA（关键小分子）对软骨退行性变化和疼痛（临床疾病）的改善角度进行的研究，值得一提的是：10-HDA的药理和生物活性也已被报道用于其他疾病，如类风湿性关节炎（RA）、结肠癌、结直肠癌、神经炎症、骨骼肌萎缩、细菌感染、结肠炎、各种实体瘤和骨质疏松症。
2）在对细胞影响的具体作用上，研究发现10-HAD通过抑制“软骨细胞衰老”（细胞表型）从而改善软骨退行性变化和疼痛，并且与ERK/p53/p21和GSK3β/p16信号轴有关；
3）下面就是这项研究的一个关键问题了：10-HAD是如何抑制“软骨细胞衰老”的？其具体的靶点是什么？研究团队通过DARTS（药物亲和力响应靶标稳定性）和CETSA（细胞热位移分析）技术鉴定ASPH为10-HDA的靶蛋白（小分子的靶点）；关于DARTS和CETSA技术的介绍大家可看推文：国自然申请|“小分子药物-蛋白互作”的7种常用技术，让专家“眼前一亮”的技术来了！；
4）那10-HAD与ASPH结合后以及下游通路和细胞衰老的影响是怎样的？ASPH是天冬氨酸β-羟化酶（ASPH），研究发现ASPH下游有两条通路：ERK/p53/p21和GSK3β/p16，其中1）10-HDA通过与ASPH结合，增强了ERK的磷酸化（p-ERK），同时抑制了p53的磷酸化（p-p53）及其下游的p21表达（下游通路1）；2）ASPH还通过直接与GSK3β相互作用来调节其活性，抑制GSK3β的活性可以减少p16的表达（下游通路2）。到p53、p21和p16大家就很熟悉了，这是与细胞衰老相关的明星分子了。
5）10-HAD与ASPH作用的具体位点是什么？这种结合对ASPH蛋白的影响什么？研究发现10-HDA与ASPH的结合具体发生在ASPH的Asp_Arg_Hydrox（591-745）结构域的糖基化位点（具体结构域和氨基酸位点），特别是氨基酸位点706；10-HDA能够保护ASPH蛋白不受蛋白酶的水解，并且这种保护作用依赖于ASPH的Asp_Arg_Hydrox结构域，因此总的来说10-HDA通过与ASPH的糖基化位点结合，增强了ASPH蛋白的热稳定性（对靶蛋白的影响）。
最后我们总结一下研究的研究要素和“套路”：
第一步（疾病相关性）：先确定要研究关键的小分子和疾病，这里小分子代谢物的思路对应的是“创新模式”（国自然申请| “代谢重编程”研究的“经典”和“创新”模式），需要确认小分子代谢物与疾病进展的“临床相关性”；
第二步（功能因果关系）：如果是小分子药物或者代谢物，则需要看到小分子药物的作用，这里就需要从体内动物模型和体外细胞层面验证小分子药物或者代谢物对疾病的影响：促进或者改善疾病表型，这里大家开展研究的时候可以加上一些“热点”，比如细胞衰老、铁代谢、线粒体自噬等等；
第三步（初步分子机制）：既然小分子（药物或者代谢物）与疾病和细胞表型有“相关性”和“因果关系”，下面就是探索具体机制了。不过机制部分我一般分为三部分（三、四和五三步），这个初步的分子机制指的是“解释细胞表型的机制”，一般对应到信号通路和明星指标就行了，比如这项研究中发现10-HAD抑制软骨细胞衰老，检测后发现细胞衰老有关的明星分子指标p53、p21和p16有改变，那就能说明10-HAD通过调控p53/p21/p16抑制细胞衰老了；
第四步（直接分子机制）：上一步能解释10-HAD抑制软骨细胞衰老是通过p53、p21和p16来实现的，但是没有说10-HAD的直接靶点是什么，以及这个直接靶点是如何调控p53/p21/p16这些明星分子的。所以这一步直接作用机制包括三部分：
1)小分子10-HAD的直接靶点ASPH的鉴定和验证；
2)小分子10-HAD与直接靶点ASPH结合后对靶点的影响是什么？
3)小分子10-HAD与直接靶点ASPH结合后，如何调控衰老指标p53/p21/p16的？
问题1中筛选和鉴定小分子的靶点方法中我们之前说过DARTS和SPR；
问题2则需要确认小分子与直接靶点结合后是影响靶点的稳定性、结构、定位、与其它蛋白的互作，抑或是其它方面？
问题3弥补直接靶点ASPH与p53/p21/p16中间的Gap就可以通过蛋白-蛋白互作、蛋白-RNA互作以及蛋白-靶基因DNA结合来进一步开展了。
第五步（精细位点机制）：这一步要回答的问题是：小分子与靶点蛋白的具体作用位点，对应到本研究中的“10-HDA与ASPH的结合具体发生在ASPH的Asp_Arg_Hydrox（591-745）结构域的糖基化位点”，这里大家可以用上分子对接、作用位点突变、蛋白的截断实验等策略，并进一步通过CESTA、SPR等技术进行验证。
好了，大家如果感兴趣，可以联系我们讨论这种思路。
最后，本周六晚7点直播，大家有什么想听的主题，可以留言给我。
