鸡传染性法氏囊病毒变异株的分离鉴定与致病性研究

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)感染导致的急性高度接触性传染类疾病，也称为甘波罗病或鸡传染性腔上囊病，常常侵害鸡的法氏囊，导致鸡的免疫功能障碍和疫苗免疫失败，是目前养鸡业中最常见的疾病之一^[1]。该病的病原体是传染性法氏囊病毒，属于一种双股RNA病毒科的禽双股RNA病毒属病毒，主要有两种血清型。在自然条件下，鸡传染性法氏囊病毒只感染鸡，且各品种鸡均易感，好发于2～15周龄的幼鸡，其中以3～6周龄鸡发病率最高。本病毒可以通过病鸡的粪便排出，造成环境、饲料和饮水污染，从而使整个鸡群经眼结膜、呼吸道和消化道传播途径而感染致病^[2～3]。临床症状主要表现为病鸡生长缓慢、饮食不振、精神萎靡、贫血消瘦，严重病鸡会发生脱水、虚弱、卧地不起、甚至死亡。剖检可见病鸡法氏囊黏膜有炎症、出血、萎缩和坏死，胸部和腿部鸡肉出血，肾脏肿胀，输尿管出现白色尿酸盐，脾脏和胃出血^[4]。近年来，该病具有发病突然、发病率高、病程短、死亡率高的特点，给养禽业造成了巨大的经济损失。因此，正确诊断本病，积极开展早期防控至关重要。临床上可以根据发病的流行特征、临床症状和病理变化进行初步诊断。若要精准地确诊，往往需要进行病毒的分离鉴定和血清学试验。本研究以江苏省扬州市某养殖场发生鸡传染性法氏囊病的30只病鸡作为研究对象，采集病料组织进行病毒分离鉴定，并对该病毒的致病性进行研究，以期为今后江苏扬州地区的鸡传染性法氏囊病的科学有效防治提供参考价值。

1.1.1 组织病料

病料无菌采自2022年1月～2022年6月在江苏扬州地区某养殖场疑似患有传染性法氏囊病的30只病鸡的法氏囊组织。

1.1.2 主要试剂与毒株

IBDV阳性标准血清（中国兽医药品监察所），Trizol总RNA提取试剂盒（Invitrogen公司），琼脂糖（OXOID),M-MLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker、d NTP、p MD18-T克隆载体、DNA连接酶、各种限制性内切酶均购自Ta Ka Ra公司，氯化钠、氯化钾、碳酸钠、盐酸等均购自国药集团的国产分析纯。IBDV阳性对照毒株（BC6/85）由中国兽医药品监察所提供。

1.2.3引物设计

根据NCBI库中公布的IBDV高度保守序列VP2基因进行引物设计，其中上游引物为DV-F:5’-CGATGATTACCAATTCTCA-3’，下游引物为DV-R:5’-GGATTATGTCTTTGAAG-3’，引物合成由上海生物生工有限公司负责完成。

1.2.1 组织病料处理

选择疑似鸡传染性法氏囊病的病鸡，观察其临床症状和病理学变化，剖检可见法氏囊明显肿大、出血，胸部和腿部肌肉出血。采集法氏囊组织，经剪碎、研磨后，加入3倍体积的PBS溶液混合制成悬液，添加5倍体积的1 000 U/m L青链霉素，充分研磨成糜粥状，转移至另一洁净的离心管中，4℃静置2 h，然后反复冻融3次，5 000 rpm离心10 min，取上层清液，备用。

1.2.2 鸡胚传代与病毒分离

使用0.22μm滤膜对上述处理后的上清液进行过滤，取0.2 m L过滤液经尿囊膜接种至10日龄的SPF鸡胚内，转移至37℃恒温培养箱内进行孵育，24 h后，照蛋观察鸡胚情况，剔除死亡的鸡胚。每间隔6 h，照蛋观察一次，随时剔除死亡的鸡胚，连续重复5次。将鸡胚转移至4℃冷却处理，无菌手术剥除蛋壳，选取尿囊膜增厚或产生痘斑病变的鸡胚和尿囊膜、尿囊液，充分研磨后，反复冻融3次，5 000 rpm离心10 min，取上清液，继续接种鸡胚，连续传代5次，收集第5代鸡胚液，用于后续试验研究。

1.2.3 RT-PCR检测

选取第5代鸡胚液，按照Trizol总RNA提取试剂盒操作流程，提取病毒总RNA。使用M-MLV逆转录酶进行逆转录合成病毒c DNA，以该c DNA基因组作为模板，以DV-F和DV-R作为上下游引物，进行PCR扩增。PCR反应体系为：2μL 10×反应缓冲液、1μL d NTPs、0.5μL上游引物DV-F、0.5μL下游引物DV-R、0.5μL Taq DNA聚合酶，1μL c DNA模板，添加灭菌双蒸水补齐至总体积20μL。PCR反应条件为：95℃预变性3 min;95℃变性40 s,49℃退火35 s,72℃延伸45 s,30个循环；72℃继续延伸5 min,4℃保存。PCR扩增反应结束后，将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳试验，并对PCR产物进行测序和序列比对分析。

1.2.4 琼脂扩散试验

按照琼脂扩散试验的常规操作步骤，制作1%浓度的琼脂板、打孔、封底，分别加入鸡胚分离的IBDV毒株、IBDV阳性对照毒株（BC6/85）、生理盐水空白对照、SPF鸡血清阴性对照，观察和比较分析各样品孔是否出现明显的白色沉淀线。

1.2.5 致病性测定

1.2.5.1 鸡胚半数致死量（ELD50）测定

使用灭菌PBS将IBDV病毒液分别稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，每个浓度接种6枚10日龄SPF鸡胚，接种量为0.2 m L/枚，同时以PBS作为阴性对照。依据Reed-Muench法来计算本研究分离病毒株的ELD₅₀。

1.2.5.2 SPF鸡致死率测定

将分离病毒分别经滴鼻的方式接种10只28日龄SPF鸡，按照每只鸡接种量为10 ELD₅₀/0.2 m L进行操作，同时以PBS滴鼻28日龄SPF鸡作为阴性对照，采取隔离饲养。攻毒后，每天观察SPF鸡的死亡情况，连续跟踪记录14 d，比较和分析病毒对SPF鸡的致死率情况。

发病鸡主要表现为精神沉郁、食欲不振、双翅下垂、虚弱消瘦、喜卧不起、排白色稀粥样粪便等临床症状。剖检可见，法氏囊明显肿大、出血、有胶冻样炎性渗出物，腿部肌肉、胸部肌肉有出血斑点，肝脏、脾脏、腺胃、肌胃等多处有出血症状。病理组织学检查发现法氏囊内有大量的异嗜性细胞浸润和增殖，脾脏和法氏囊滤泡中可见B淋巴细胞发生一定程度的破裂和崩解。

分离病毒株经提取RNA后，进行RT-PCR检测的琼脂糖凝胶电泳结果可见一条大小为709 bp的特异性电泳条带，与预期目的条带大小相一致，见图1。经进一步的基因测序，发现这些鸡群中存在两种变异病毒株，其基因序列存在不一致，将分离获得的病毒株命名为IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。

琼脂扩散试验显示，IBDV阳性对照毒株（BC6/85）、分离毒株IBDVYZ-1、分离毒株IBDVYZ-2三株病毒株的琼脂板样品孔均出现了明显的白色沉淀线，阴性对照却未见任何明显的沉淀线，这说明分离毒株IBDVYZ-1、分离毒株IBDVYZ-2和IBDV阳性对照毒株能够与IBDV血清发生反应。

将分离病毒株和阳性对照病毒株分别稀释成不同浓度梯度来接种SPF鸡胚，测定其毒价，依据Reed-Muench法计算0.2 m L尿囊膜悬浮液中的病毒ELD₅₀，结果显示IBDVYZ-1病毒株的ELD₅₀为10^5.5/0.2 m L,IBDVYZ-2病毒株的ELD₅₀为10^6.5/0.2 m L,IBDV阳性对照毒株（BC6/85）的ELD₅₀为10^6.0/0.2 m L。通过人工接种感染SPF鸡试验结果显示，感染14 d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率为70.0%(7/10),IBDVYZ-2病毒株的致死率为100.0%(10/10),IBDV阳性对照毒株（BC6/85）的致死率为90.0%(9/10）。详细数据见表1所示。

鸡传染性法氏囊病最早见报道是在1962年美国特拉华州甘布罗镇某肉鸡群，随后陆续流行至英国、印度、中国、日本等国家，常导致病鸡体重下降、脱水、出血和死亡^[1,5]。本病可发生于任何品种的鸡，尤以肉鸡最易感，常发生于2～15周龄的鸡，且最易发于3～6周龄的鸡，可通过接触病鸡的饲料、粪便、饮水、用具等方式传播，一旦感染，死亡率可高达70%以上，给养鸡业的发展造成了较大的影响^[6]。因此，积极正确地诊断鸡传染性法氏囊病，对于群体发病的防控具有重要意义。

目前，为了精准确诊，一般均采取病毒分离和血清学鉴定。孟凯等^[7]通过对山东省不同地区的疑似传染性法氏囊病的病鸡采集病料，分离鉴定出3株鸡传染性法氏囊病毒株，同源性为96.3%～99.3%。揭鸿英等^[8]通过对江苏地区的鸡传染性法氏囊病毒的分离和鉴定，获得一株超强毒株NJ09，且对60日龄的SPF鸡致死率达到100%。严专强等^[9]通过对广东省某肉鸡场中的疑似鸡传染性法氏囊病的病鸡中分离出一株毒性较强的病毒株，与经典毒株的同源性为97.5%，口服接种SPF鸡后可导致鸡死亡，法氏囊出现严重萎缩和出血症状。

本研究通过对江苏扬州地区某养殖场疑似患有鸡传染性法氏囊病的30只鸡进行观察，并采集病料、分离鉴定，结果表明病鸡呈典型的鸡传染性法氏囊病临床病理特点；提取病毒RNA后，经RT-PCR检测的琼脂糖凝胶电泳显示有一条大小为709 bp的特异性电泳条带，测序比对分析发现该鸡群中存在两种类型的变异病毒株，分别命名为IBDVYZ-1和IBDVYZ-2。琼脂扩散试验显示IBDV阳性对照毒株（BC6/85）、分离毒株IBDVYZ-1、分离毒株IBDVYZ-2三株病毒株的琼脂板样品孔均出现明显的白色沉淀线，阴性对照却未见任何明显的沉淀线，这说明分离毒株IBDVYZ-1、分离毒株IBDVYZ-2和IBDV阳性对照毒株能够与IBDV血清发生反应。此外，在致病性研究中显示，IBDVYZ-1病毒株的ELD₅₀为10^5.5/0.2 m L,IBDVYZ-2病毒株的ELD₅₀为10^6.5/0.2 m L,IBDV阳性对照毒株（BC6/85）的ELD₅₀为10^6.0/0.2 m L。通过人工接种感染SPF鸡试验结果显示，感染14d后，IBDVYZ-1病毒株的致死率为70.0%(7/10),IBDVYZ-2病毒株的致死率为100.0%(10/10),IBDV阳性对照毒株（BC6/85）的致死率为90.0%(9/10）。本研究的上述结果与目前国内发现的鸡传染性法氏囊病相关研究报道文献较一致^[7-10]。

综上所述，本研究选取了江苏省扬州地区某养殖场发生鸡传染性法氏囊病的30只病鸡作为研究对象，采集病料组织，成功地分离鉴定出鸡传染性法氏囊病毒变异株，并在致病性方面开展了研究，这为今后江苏扬州地区的鸡传染性法氏囊病的科学有效防治提供参考价值。

[1]  崔德桂.鸡传染性法氏囊病毒变异株的分离鉴定与致病性研究

[J].家禽科学,2024,46(05):38-42.