细胞"清洁工"出故障，研究揭示帕金森病背后的分子机制

文摘 2024-11-06 23:38 美国

当细胞的清洁工罢工时，大脑会怎样？

在我们的大脑里，有着数以亿计的神经细胞在不知疲倦地工作着。但在帕金森病患者的大脑中，这些珍贵的神经细胞却在悄悄死去。为什么会这样呢？科学家们发现，问题可能出在细胞内的"垃圾处理系统"——溶酶体上。就像城市需要完善的垃圾处理系统一样，我们的细胞也需要溶酶体来及时清理各种细胞垃圾。当这个系统出现故障时，垃圾就会在细胞中堆积，最终导致细胞生病、死亡。

近年来，科学家发现VPS35基因的D620N突变与帕金森病密切相关。这就像一个精密机器中的关键零件出现了问题，导致整个机器运转失常。更让人好奇的是，这个突变似乎会影响另一个与帕金森病相关的蛋白——LRRK2。LRRK2就像是细胞中的指挥官，负责调控多个重要过程。但究竟VPS35的突变是如何影响LRRK2的功能，又是怎样导致溶酶体出问题的呢？

英国邓迪大学等研究团队在Science Advances 期刊在线发表了一篇题为《帕金森病相关VPS35[D620N]突变诱导LRRK2介导的RILPL1和TMEM55B在溶酶体上的相互作用》的研究论文。研究发现帕金森病相关的VPS35[D620N]突变通过激活LRRK2激酶，促进RILPL1与溶酶体膜蛋白TMEM55B的结合，从而影响溶酶体功能。

这项研究采用了多层次的实验方法来探究VPS35[D620N]突变对溶酶体功能的影响。首先，研究团队利用CRISPR-Cas9技术构建了VPS35[D620N]敲入小鼠，并从小鼠胚胎分离培养成纤维细胞(MEFs)。为了分析溶酶体蛋白组变化，他们使用LysoTag (TMEM192-3xHA)标记系统特异性富集溶酶体，结合数据非依赖性采集(DIA)质谱技术进行蛋白质组学分析。在分子机制研究中，通过免疫共沉淀、Western blot、phos-tag凝胶电泳等方法检测蛋白相互作用和磷酸化水平。同时，利用共聚焦显微镜和扩展显微镜技术观察蛋白的细胞定位。为了验证LRRK2激酶活性的作用，研究人员使用了特异性抑制剂MLi-2进行体内外实验，包括对小鼠进行为期2周的MLi-2饲料喂养。此外，通过生物信息学分析和AlphaFold结构预测，深入研究了RILPL1与TMEM55B的相互作用界面。

VPS35[D620N]突变重塑溶酶体蛋白组

研究团队首先利用LysoTag免疫沉淀结合质谱分析方法，比较了野生型和VPS35[D620N]突变MEFs细胞的蛋白表达谱。结果显示在全细胞裂解液中，D620N突变导致363个蛋白表达改变，其中70个上调(0.82%)、293个下调(3.44%)。在溶酶体组分中，81个蛋白上调、136个下调。GO功能富集分析表明，这些改变的蛋白主要涉及细胞外基质、糖胺聚糖结合、空泡膜、跨膜转运等功能。

LRRK2激酶调控RILPL1的稳定性

VPS35[D620N]突变特异性增加RILPL1在溶酶体而非高尔基体上的定位。使用LRRK2激酶抑制剂MLi-2处理可逆转这一现象。在VPS35[D620N]小鼠大脑和肺组织中，RILPL1总蛋白水平降低约40%。MLi-2饲料喂养2周可使RILPL1水平恢复，在大脑中升高1.6倍，在肺组织中升高2.5倍。蛋白酶体抑制剂MG-132而非溶酶体蛋白酶抑制剂可阻止RILPL1降解，表明RILPL1通过蛋白酶体途径降解。

RILPL1与TEME55B的互作机制

质谱分析发现TMEM55B是RILPL1的新相互作用蛋白。免疫共沉淀实验证实，这种相互作用依赖于LRRK2激酶活性。通过截短突变分析发现，RILPL1 C端的最后8个氨基酸(394-401)是与TMEM55B结合的关键区域。而TMEM55B的80-160氨基酸保守结构域负责与RILPL1结合。进一步的突变分析表明R151E突变可完全阻断两者相互作用。

溶酶体应激诱导RILPL1募集

溶酶体损伤剂LLOMe处理可诱导RILPL1募集到溶酶体。在野生型MEFs中，LLOMe导致溶酶体RILPL1水平升高1.5倍。在VPS35[D620N] MEFs中，这种升高更显著，达到2.5倍。LLOMe处理也导致Rab10磷酸化水平中等程度升高，但低于D620N突变诱导的水平。

细胞功能改变

VPS35[D620N]突变显著影响细胞的多个功能。在纤毛形成方面，只有43%的突变细胞形成纤毛，而MLi-2处理后可恢复到63%。此外，突变还导致溶酶体在细胞核周围异常聚集，使用MLi-2处理可改善这种异常分布。这些结果表明VPS35[D620N]突变通过LRRK2信号通路影响多个细胞功能。

总结

这项研究阐明了一条新的信号通路:VPS35[D620N]突变导致溶酶体功能紊乱，继而激活LRRK2激酶并促进其在溶酶体上的定位。活化的LRRK2磷酸化Rab蛋白，进而招募RILPL1与溶酶体膜蛋白TMEM55B结合,最终影响溶酶体功能。这一发现为理解帕金森病的发病机制提供了新的视角,也为开发针对性治疗策略提供了潜在靶点。

论文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adj1205

撰文｜Coral

责编｜Asher

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