肌萎缩侧索硬化症，又称渐冻症，是一种可怕的神经退行性疾病，目前尚无有效治疗手段。如果有一种方法可以只在出现病变的神经元中表达治疗基因，会不会大大提高治疗效果并降低副作用？
TDP-43在渐冻症中扮演着至关重要的角色。它是一种主要存在于细胞核中的RNA结合蛋白，对维持神经元正常功能至关重要。在97%的渐冻症病例中，TDP-43会错误定位到细胞质并形成异常聚集体，导致其正常功能丧失。这种功能缺失会引发一系列有害事件，如异常的RNA剪接和关键基因表达失调，从而加速神经元退化。因此，TDP-43的病理变化被认为是渐冻症发病机制中的核心环节之一。
2024年10月3日，伦敦大学学院等研究团队在 Science 期刊发表了一篇题为《创建新型隐蔽剪接用于肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆精准医疗》的研究论文。研究人员开发出一种名为TDP-REG的新型基因疗法技术，可以精准地在发生TDP-43功能丧失的细胞中表达治疗基因，为治疗渐冻症、额颞叶痴呆等神经退行性疾病提供了新的希望。隐蔽剪切是一种特殊的基因表达现象。我们的基因像是一本指导手册，那么通常情况下，细胞会按照特定的章节来阅读和执行指令。但有些"隐藏章节"通常被忽略，因为它们可能包含错误信息。在正常情况下，特殊的"编辑"蛋白（如TDP-43）确保这些隐藏章节不被使用。然而，在某些疾病中，这些"编辑"蛋白可能出现问题，导致隐藏章节被错误使用，从而产生异常蛋白质或无法产生必需蛋白质，引发细胞功能紊乱。研究团队开发了TDP-REG（TDP-43 Regulated Expression Gene）系统，利用TDP-43功能缺失时特异性出现的隐蔽剪接事件来调控目的基因的表达。他们设计了两种策略：TDP-REGv1将目的基因与上游调控模块融合；TDP-REGv2则将合成的剪接传感器嵌入目的基因序列内。研究人员还开发了SpliceNouveau算法，结合深度学习和理性设计原理来优化载体设计。他们在人类神经母细胞瘤细胞系、TDP-43条件性敲除小鼠、人类胚胎肾细胞和诱导多能干细胞来源的神经元中进行了验证实验。在体外实验中，研究人员在SK-N-BE(2)细胞中测试了27种由SpliceNouveau算法设计的TDP-REGv2载体。结果显示，其中13个载体在TDP-43敲低后表达量显著增加。特别值得注意的是，有两个构建体实现了100倍以上的表达增加。通过纳米孔测序进一步验证了56个载体的剪接情况，证实了优化程度较高的载体更可能以预期方式剪接。为了验证TDP-REG在体内的功能，研究人员将TDP-REGv1 mCherry和TDP-REGv2 mScarlet（构建体7）的AAV注射到TDP-43条件性敲除（cKO）小鼠的脊髓中。结果显示，在cKO小鼠的运动神经元中，这两种载体均表现出显著的表达。具体而言，除了一个案例外，每种构建体至少在50%的已识别运动神经元中有明显表达。相比之下，对照小鼠（TDP-43Fl/wt; Chat-Cre+/wt）中只有0-2%的运动神经元检测到mCherry或mScarlet的表达。这一结果强烈证明了TDP-REG载体在体内的高度特异性。研究人员开发了一种基于TDP-REGv1和TDP-REGv2的高灵敏度发光生物标志物，使用高斯鹦鹉荧光素酶（Gluc）作为报告基因。在SK-N-BE(2)细胞中，最佳的TDP-REGv2载体实现了>200倍的Gluc表达增加，同时保持了极低的基础泄漏表达。这种高灵敏度的生物标志物有望用于监测类器官和动物模型中的TDP-43功能丧失情况。在基因组编辑方面，研究人员设计了一种TDP-REGv2编码的质粒编辑（PE）构建体，其中部分Cas9序列由TDP-REG隐蔽外显子编码。通过RT-qPCR和Western blot验证，该隐蔽外显子几乎没有泄漏表达。使用这种构建体在SK-N-BE(2)细胞中进行UNC13A隐蔽供体剪接位点的编辑实验，结果显示仅在TDP-43敲低的细胞中发生编辑，而在正常细胞中几乎不发生编辑。这一结果表明，TDP-REG可以确保基因组编辑仅在有益的细胞中进行，最大限度地减少潜在的脱靶效应。研究人员设计了编码TDP-43/Raver1融合蛋白的TDP-REGv2载体，这种融合蛋白可以模拟TDP-43的剪接抑制功能。在SK-N-BE(2)细胞中进行的实验显示，这些载体能够抑制85%以上的UNC13A和AARS1隐蔽外显子，以及约40%的STMN2隐蔽外显子。值得注意的是，带有隐蔽外显子的载体（特别是9号载体）在TDP-43敲低后表现出比组成型载体更高的TDP-43/Raver1表达水平和更有效的内源性隐蔽外显子抑制。研究人员还在iPSC来源的皮层神经元中测试了这些载体的功能。结果显示，TDP-REGv2:Raver1载体能够有效地修复UNC13A隐蔽剪接，并恢复突触处的UNC13A蛋白表达。这一发现对于治疗ALS和FTD具有重要意义，因为UNC13A隐蔽外显子的激活会导致这种关键突触前蛋白的丧失。此外，研究人员观察到，表达受TDP-REG调控的TDP-43/Raver1的细胞比表达组成型TDP-43/Raver1的细胞具有显著的生长优势）。这一结果进一步证明了TDP-REG技术在避免持续表达TDP-43/Raver1所导致的潜在毒性方面的优势。这项研究开发的TDP-REG系统可以实现TDP-43病理特异性的基因表达，为渐冻症等神经退行性疾病提供了一种新的精准治疗策略。它不仅可以用于表达治疗基因，还可以进行病理特异性的基因组编辑。TDP-REG在细胞和动物模型中表现出高度的特异性和有效性，有望降低基因治疗的脱靶风险，提高治疗效果。这种方法可能为开发更安全、更有效的渐冻症基因治疗手段铺平道路，也可能应用于其他TDP-43相关的神经退行性疾病。
论文链接：
https://www.science.org/doi/10.1126/science.adk2539
