帕金森病关键蛋白质的3D结构被破解

文摘 2024-11-07 23:37 美国

多胺是如何在细胞内外运输的呢？

在我们的身体里，有一类叫做"多胺"的小分子，它们就像细胞生命中的"万能助手"，帮助细胞制造蛋白质、修复DNA、应对压力。但是，这些"万能助手"需要在细胞的不同区域之间穿梭才能发挥作用。科学家发现，一个叫做ATP13A2的蛋白质就像一位"搬运工"，负责将多胺从细胞内的一个小室（溶酶体）运送到细胞质中。

有趣的是，当这位"搬运工"ATP13A2出现问题时，人们就可能患上帕金森病等神经退行性疾病。就像一个运输公司的配送系统出现故障，货物无法及时送达，整个城市的运转都会受到影响。但是，ATP13A2究竟是如何完成这项精密的运输工作的呢？这个问题一直困扰着科学家们。现在，研究人员通过高科技的冷冻电镜技术，首次看清了ATP13A2的三维结构，揭示了其工作原理，为治疗相关疾病开辟了新的思路。

加州大学伯克利分校等研究团队在 Molecular Cell 期刊在线发表了一篇题为《人类ATP13A2（PARK9）转运多胺的结构基础》的研究论文。研究人员通过冷冻电镜技术首次解析了人类多胺转运蛋白ATP13A2的结构，阐明了其转运多胺的分子机制，为理解帕金森病等神经退行性疾病提供了新的见解。

研究团队利用昆虫细胞表达系统获得人类ATP13A2蛋白，通过冷冻电镜技术解析了其在五种不同构象下的高分辨率结构（分辨率为2.5-3.7埃），并结合生化实验和分子动力学模拟，阐明了ATP13A2转运多胺的分子机制。

研究方法

这项研究首先需要获得足够量的ATP13A2蛋白质样品。研究团队选用昆虫细胞（Sf9细胞）表达系统，将人类ATP13A2的基因序列克隆到pFastBac1载体中。为了便于纯化和检测，他们在蛋白质C端设计了HRV 3C蛋白酶切位点和GFP荧光标签。通过杆状病毒表达系统，将基因导入昆虫细胞进行大量表达。

1. 蛋白质纯化

由于ATP13A2是一个膜蛋白，纯化过程较为复杂。首先需要制备微粒体，即将培养的昆虫细胞收集并破碎，通过差速离心去除细胞碎片和核糖体，再通过超速离心收集含有目标蛋白的膜组分。然后使用去污剂（DDM和CHS）将蛋白质从膜中提取出来，利用抗GFP纳米抗体亲和层析进行初步纯化，最后通过分子筛层析获得高纯度的样品。

2. 结构解析

研究团队使用冷冻电镜技术解析ATP13A2的结构。他们将纯化的蛋白质样品快速冷冻在特殊的碳膜网格上，使用高端冷冻电镜（Titan Krios）采集高质量图像。通过专业软件（Warp、cryoSPARC等）对大量图像进行处理和分类，最终获得了2.5-3.7埃分辨率的三维结构。随后使用Coot和Phenix等软件构建和优化原子模型。

3. 功能验证

为了验证结构中观察到的关键氨基酸的功能，研究人员进行了一系列生化实验。他们制备了含有不同ATP13A2突变体的微粒体，通过测定ATP水解活性来评估这些突变对蛋白质功能的影响。具体使用发光法检测不同浓度精胺存在下的ATP酶活性，通过比较野生型和突变体的活性来确定关键氨基酸的作用。

4. 分子动力学模拟

为了理解ATP13A2在脂质膜环境中的动态行为，研究团队进行了计算机模拟。他们使用Martini力场构建了粗粒化模型，模拟ATP13A2在类溶酶体膜环境中的行为，分析了蛋白质与周围脂质分子的相互作用。

5. 质谱分析

研究人员还使用纳升电喷雾电离质谱技术来确认与ATP13A2结合的多胺分子。这项技术能够精确测定样品中存在的分子种类和含量，为结构中观察到的多胺分子提供了独立的验证。

ATP13A2的独特结构特征

ATP13A2展现出典型的P型ATP酶结构特征，在细胞质侧包含执行器（A）、核苷酸结合（N）和磷酸化（P）三个结构域，以及10个跨膜螺旋（TMs 1-10）。值得注意的是，ATP13A2具有两个独特的结构特征：一个180个氨基酸长的N端结构域（NTD）和一个C端延伸区（CTE）。其中NTD包含三个疏水性α螺旋（Ha、Hb和Hc），这些螺旋以三角形状排列并嵌入细胞膜的细胞质侧，可能在蛋白质的膜定位中发挥重要作用（图1A-1C）。

多胺结合口袋的精确解析

在E2P构象下，研究人员发现蛋白质形成了一个面向溶酶体内腔的口袋。通过表面静电势计算表明，该口袋呈现负电性，主要由多个暴露的天冬氨酸和谷氨酸残基（D249、E451和D955）形成。即使在溶酶体内的低pH环境下（pH 5.0），该口袋仍保持整体负电性。这个带负电的口袋长约10埃，入口处半径约1.8埃，非常适合吸引和容纳带正电的多胺分子。

多胺与ATP13A2的互作机制

在E2-Pi构象下，研究人员清晰地观察到了一个结合的精胺分子。精胺呈伸展构象，其四个氨基中的三个与ATP13A2的酸性和芳香氨基酸残基形成了复杂的相互作用网络：一个中间氨基与Y251、D458和F958相互作用，另外两个外侧氨基分别与D249、D955和D962形成配位。通过ATPase活性测定实验证实，突变这些关键氨基酸（如D458N、D962N、W246V、Y251M和F958V）会导致ATP13A2对精胺的响应能力完全丧失。

ATP13A2的构象转换过程

研究团队通过解析五种不同状态下的结构，揭示了ATP13A2的完整工作循环。在E2P状态下，底物结合口袋向溶酶体内腔开放；当多胺结合后，蛋白质转变为E2-Pi状态，形成一个更深的柱状腔体（约15埃长）；随后通过E1构象的变化，将多胺运送到细胞质侧。分子动力学模拟进一步显示，ATP13A2周围的带负电磷脂（如PA和PI(3,5)P2）可能通过与蛋白质表面的正电荷区域相互作用，协助多胺的释放过程。

疾病相关突变的结构基础

研究人员将已知的疾病相关突变位点映射到ATP13A2结构上，发现多数突变可能通过影响蛋白质的折叠而导致功能缺陷。特别是F177L突变位于NTD的β折叠层，而P837L突变位于P结构域和CTE的界面。通过删除突变实验证实，虽然缺失NTD的突变体（ΔNTD）仍保持活性，但缺失CTE的突变体（ΔCTE）完全丧失了ATPase活性，说明CTE对ATP13A2的功能和结构稳定性至关重要。

总结

这项研究首次揭示了ATP13A2的分子结构和多胺转运机制，阐明了其与帕金森病等神经退行性疾病之间的关系，为开发针对这些疾病的新型治疗策略提供了重要的结构基础。

论文链接：

https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(21)00684-5

撰文｜Coral

责编｜Asher

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