Nature | 溶酶体功能障碍如何引发脑部疾病？

文摘 2024-11-08 22:49 美国

我们都知道，帕金森病会导致患者的运动障碍和认知功能下降，但是否好奇过，为什么一个小小的ATP13A2基因突变，就能让大脑中的神经细胞逐渐凋亡，最终引发如此严重的疾病？

在我们的大脑中有数以亿计的神经细胞，它们精密协调、默契配合，让我们能够思考、运动、感知世界。然而，在帕金森病等神经退行性疾病中，神经细胞会不断死亡，就像城市中的灯光一盏盏熄灭。科学家们发现，这些疾病与一个名为ATP13A2的基因密切相关，但具体如何影响神经细胞的生死却一直是个谜。

每个细胞都有自己的"垃圾处理站"——溶酶体，它负责分解和回收各种细胞废物。就像城市需要完善的垃圾处理系统一样，溶酶体的正常运转对细胞健康至关重要。研究发现，ATP13A2基因的突变会导致溶酶体功能紊乱，就像垃圾处理站发生故障，可是究竟是哪个环节出了问题？

比利时鲁汶大学等研究团队在 Nature 期刊发表了一篇题为《ATP13A2缺失破坏溶酶体多胺外排功能》的研究论文。研究发现ATP13A2是一种溶酶体多胺外排转运体，其功能缺失会导致多胺在溶酶体内积累，引起溶酶体功能障碍，最终导致神经细胞死亡。

研究团队采用了多学科交叉的研究方法，包括生物化学分析、细胞实验、基因编辑、代谢组学分析等。他们构建了ATP13A2基因敲除的细胞模型，并在人类神经母细胞瘤细胞系、小鼠原代神经元和线虫模型中进行了验证。具体而言：

1. 功能鉴定实验

研究团队首先在微粒体膜制剂中筛查ATP13A2可能的底物，测试了多种物质对其ATPase活性的影响。通过放射性标记的ATP研究ATP13A2的磷酸化和去磷酸化过程。为了直接证明其转运功能，研究人员将纯化的ATP13A2蛋白重组到人工脂质体中，使用3H标记的精胺进行转运实验。

2. 细胞模型构建

研究人员利用CRISPR-Cas9技术在人类神经母细胞瘤细胞系（SH-SY5Y）中敲除ATP13A2基因。随后通过慢病毒转导系统，在敲除细胞中重新表达野生型或突变型ATP13A2。为了评估ATP13A2的功能，他们开展了代谢组学分析来测定细胞内多胺含量，并使用荧光标记的多胺研究其细胞内分布。同时，他们还进行了一系列溶酶体功能检测，包括pH测定、蛋白酶活性分析和膜完整性评估。

3. 动物实验验证

研究在小鼠和线虫两个模型中进行了验证。从胚胎期（E16）小鼠分离出皮层神经元进行原代培养，通过慢病毒介导的miRNA技术降低ATP13A2的表达。在线虫模型中，他们分析了ATP13A2同源基因（catp-5、catp-6、catp-7）缺失对发育的影响。

4. 突变体研究

通过定点突变技术，研究人员构建了与Kufor-Rakeb综合征和早发性帕金森病相关的ATP13A2突变体。他们通过生化分析测定了这些突变体的ATPase活性和多胺转运功能，并在细胞水平评估了突变体对溶酶体功能的影响。

A2多胺转运功能的发现

研究团队首先筛查了ATP13A2可能的底物。在微粒体膜制剂中，精胺（SPM）和亚精胺（SPD）能显著刺激ATP13A2的ATPase活性，而其他二胺类、单胺类和氨基酸类物质则无此效应。其中精胺的激活效果最强，半数有效浓度（EC50）为0.3 mM。进一步研究发现，精胺可促进ATP13A2的去磷酸化，这表明精胺很可能是ATP13A2的转运底物。在体外重构的脂质体系统中，ATP13A2可将3H标记的精胺从腔内转运到外侧。这些结果证实ATP13A2是一个具有选择性的多胺转运体。

多胺代谢调控

代谢组学分析显示，与对照组相比，ATP13A2敲除细胞中精胺和亚精胺含量显著降低（分别降低约50%和30%）。当在ATP13A2敲除细胞中重新表达野生型ATP13A2时，细胞内多胺水平得到恢复；而表达无活性的D508N突变体则不能恢复多胺水平。利用BODIPY标记的多胺进行示踪实验发现，ATP13A2促进细胞对多胺的摄取。在ATP13A2缺失细胞中，荧光标记的多胺主要积累在LAMP1阳性的晚期内体/溶酶体中；而在表达正常ATP13A2的细胞中，多胺在胞质和细胞核中均有分布。这表明ATP13A2通过调控溶酶体多胺外排来维持细胞内多胺稳态。

溶酶体功能损伤

在ATP13A2敲除细胞中，研究人员观察到了严重的溶酶体功能异常。与对照组相比，ATP13A2缺失细胞的溶酶体pH升高（从pH 4.5升至pH 5.5），蛋白降解功能受损。当给予外源性精胺（10 μM）刺激时，这些异常进一步加重。更重要的是，ATP13A2缺失导致溶酶体膜完整性破坏，cathepsin B酶从溶酶体释放到胞质（活性升高3-4倍）。通过电镜观察发现大量溶酶体破裂。这些异常可被酸性纳米颗粒（180 ng/ml）或cathepsin B抑制剂CA-074（25 μM）所逆转，同时细胞存活率也得到改善。

突变体功能分析

研究人员分析了与Kufor-Rakeb综合征（KRS）和早发性帕金森病相关的ATP13A2突变体。结果发现，与KRS相关的T512I和G872R突变体完全丧失了ATPase活性和多胺转运功能。而与早发性帕金森病相关的T12M、G528R和A741T突变体仍保留部分活性，其对精胺的亲和力降低，且多胺转运功能部分受损。这种功能缺陷的严重程度与临床表型具有良好的相关性。在神经元和线虫模型中的实验进一步验证了这一发现。

动物模型验证

在原代培养的小鼠皮层神经元中，敲低ATP13A2表达会增加细胞对精胺毒性的敏感性。24小时10 μM精胺处理后，ATP13A2表达下调的神经元死亡率显著升高（约增加40-50%）。这种效应可被cathepsin B抑制剂CA-074（10 μM）所减轻，也可通过回补野生型ATP13A2（而非D508N突变体）得到挽救（图4a、b）。在线虫模型中也观察到类似现象：ATP13A2同源基因（catp-5、catp-6或catp-7）缺失会加重亚精胺对生长发育的抑制作用。

总结

这项研究揭示了ATP13A2是一个溶酶体多胺外排转运体，其功能缺失会导致多胺在溶酶体内异常积累，引起溶酶体功能障碍和神经细胞死亡。这一发现不仅阐明了ATP13A2相关神经退行性疾病的分子机制，也为开发新的治疗策略提供了重要线索。

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-020-1968-7

撰文｜Coral

责编｜Asher

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