TCR是T细胞免疫的核心成员。“眼见为实”,看见TCR很重要...
技术 | 优势 | 劣势 | 应用场景 |
扫描电镜 | 超高分辨率(可达1nm) | 要求牢固固定 | T细胞微绒毛的可视化 |
透射电镜 | 截面超高分辨率(可达0.1nm) | 要求牢固固定和薄切片 | TCR纳米团簇的可视化;微绒毛中细胞骨架丝的可视化 |
共聚焦显微镜 | 荧光团的高对比度成像(横向250nm分辨率,轴向500nm) | 一次成像一个小面积,衍射受限,轴向分辨率差 | 细胞或大的超分子结构的成像,如免疫突触 |
全内反射荧光显微镜 | 有限的成像深度增加了对比度;可以与超分辨率技术相结合 | 要求表面贴装样品;靠近玻璃的荧光团的潜在成像偏差 | 基底细胞膜的成像,包括人工突触;对固定的和活的T细胞中的单个分子进行成像 |
光片荧光显微镜 | 有限的成像切面增加了轴向分辨率;可与超分辨率技术相结合;被成像的平面可以在z方向上移动 | 目前还不广泛使用;样品准备和客户定制的显微镜是限制因素 | 活T细胞和固定T细胞的膜蛋白和胞质蛋白的全细胞三维超分辨率成像和四维跟踪 |
结构化照明显微镜 | 超分辨率法(100 nm分辨率);大的采集面积,提高三维分辨率 | 仅两倍分辨率的衍射限制技术;高度的光漂白(厚样品单处理不理想) | 观察静息T细胞TCR的分布和激活后TCR的运动 |
受激辐射损耗显微镜 | 超分辨率方法(20 nm分辨率);适用于实时和三维成像 | 高度的光漂白;荧光团的选择有限 | 观察静息T细胞TCR的分布和激活后TCR的运动 |
双螺旋点扩散函数显微镜 | 超分辨率方法(20 nm分辨率);适用于实时和三维成像(20 nm轴向分辨率);单分子跟踪 | 扩展的PSF需要低密度标记/表达 | 可视化TCR在T细胞激活不同阶段的分布,TCR在膜内的动态跟踪 |
光活化定位显微镜(PALM),随机光学重建显微镜(STORM) | 超分辨率单分子定位方法(20 nm分辨率);单分子跟踪(PALM) | 长时间的采集和处理时间;荧光团选择有限(特别是PALM);难以应用于活细胞 | 观察静止T细胞中TCR与微绒毛的分布和激活后的TCR动态 |
DNA-PAINT技术 | 超分辨率单分子定位法(20 nm分辨率),多通道检测,采集时间短,减少光漂白 | 高背景荧光(用TIRFM或LSM降低) | 测量CD45和TCR激活后的分子间距离和分子动力学 |
荧光共振能量转移 | 超精确和灵敏的近端定位方法(1.5 nm分辨率);可以看到可视化的分子内构象变化;可以提供共定位和动力学信息 | 需要两个荧光团可能会扰乱蛋白质的功能;严格的成像条件 | 监测活细胞激活后TCR/CD3的动态;测量TCR复合物的化学计量;检测TCR的构象变化 |
荧光相关光谱 | 从不需要超分辨率获取的自相关函数推断分子行为的光谱学技术 | 需要低密度标记和小面积的获取;主要适用于活细胞,静息T细胞难以捕获 | 测定TCR复合物的化学计量;测量激活前后的TCR动态和集簇 |