邓积凯，龚飞宇，李颖健，谭雪，刘雪梅，杨世敏，陈仙莹，王虹运，刘乾运，沈超，周立，陈宇
a 武汉大学生命科学学院，病毒学国家重点实验室
b 武汉大学动物实验中心/ABSL-III实验室/疫苗研究院
摘要
冠状病毒的一个独特特性是它们利用自身编码的非结构性蛋白16（nsp16），即2'-O-甲基转移酶（2'-O-MTase），通过核糖2'-O-甲基化修饰对其RNA进行加帽反应。这一过程对于维护病毒基因组稳定性、促进有效的翻译以及实现免疫逃逸至关重要。尽管对SARS-CoV-2 nsp16/nsp10的超微结构已有相当进展，但对其分子机制的了解目前还很有限。在本研究中，我们系统性地研究了SARS-CoV-2中nsp16的2'-O-MTase活性，重点关注其对于nsp10刺激的依赖性。我们观察到由于保守的相互作用界面，nsp16与nsp10在不同的冠状病毒之间存在交叉反应性。然而，在SARS-CoV-2 nsp10中的单个残基替换（K58T）限制了MERS-CoV nsp16的功能激活。进一步地，辅因子nsp10有效地增强了nsp16与底物RNA以及甲基供体S-腺苷基-L-甲硫氨酸（SAM）的结合。从机制上讲，nsp10的His-80、Lys-93和Gly-94分别与nsp16的Asp-102、Ser-105和Asp-106相互作用，进而稳定了SAM结合口袋。nsp10的Lys-43与nsp16的Lys-38和Gly-39相互作用，动态调节RNA结合口袋，并促进RNA精确绑定到nsp16/nsp10复合物中。通过评估nsp16/nsp10复合物的构象表位，我们进一步确定了参与2'-O-MTase活性的关键残基。此外，我们利用体外生化平台筛选了针对2'-O-MTase活性的潜在抑制剂。总体来说，我们的结果显著增强了对病毒2'-O甲基化过程和机制的理解，为抗病毒药物开发提供了有价值的靶点。
Fig. 1. Identification of SARS-CoV-2 2′-O-MTase activity.
Fig. 2. Affinity analysis of SARS-CoV-2 nsp16/nsp10 for RNA or SAM binding.
Fig. 3. Biochemical parameters associated with the 2′-O-MTase activity of SARS-CoV-2 nsp16/nsp10.
Fig. 4. Analysis of protein conformation and mutational effects on 2′-O-MTase activity of SARS-CoV-2 nsp16/nsp10 in vitro.
Fig. 5. Nsp10-mediated SAM binding mode and RNA binding pattern.
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