重点号 | 177Lu-液态金属ROS放疗增敏剂的合成及对小鼠乳腺癌疗效的初步研究

¹⁷⁷Lu是目前最常用于放射性治疗的金属核素［1］。放射性标记功能性纳米颗粒能克服乏氧微环境下的辐射抵抗，明显提高放射治疗效果［2-3］。但是，纳米颗粒的放射性标记通常需要化学偶联特定的螯合剂和连接剂，易对纳米材料的结构、性能和稳定性产生干扰［4］。液态金属(liquid metal, LM)重塑性优、可修饰性强、生物相容性良好，是一种新型生物医用材料［5］。尤其在细菌、细胞内，LM可代谢产生高浓度的Ga3+离子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)，是一种潜在的生物响应性放疗增敏剂［6-7］。同时，LM可通过多种理化途径结合多种金属(单质或离子)，构建多种合金及复合材料。¹⁷⁷Lu标记LM可通过合金化作用提供快速、高效、稳定的放射性标记［8］。通过标记LM基多功能纳米颗粒，¹⁷⁷Lu可随纳米颗粒代谢，提高靶向性和稳定性，同时LM可产生ROS发挥放疗增敏作用。本研究利用水相LM纳米液滴(LM nanodroplet, LMND)“一锅法”结合¹⁷⁷Lu3+，高效制备新型¹⁷⁷Lu标记LM基ROS放疗增敏剂［¹⁷⁷Lu-LMND@超支化聚合物(hyperbranched polymer, HG)］，并在小鼠乳腺癌移植瘤模型上进行抗肿瘤研究，评价其放疗增敏效果。

1.材料与仪器。镓铟共熔合金［阿法埃莎(中国)化学有限公司］；¹⁷⁷LuCl₃(中国同辐股份有限公司)；胎牛血清、1640培养基(美国Gibco公司)；N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(N,N′-methylene bisacrylamide, MBA)、1-(2-氨乙基)哌嗪［1-(2-aminoethyl)piperazine, AEPZ］(美国Sigma-Aldrich公司)；1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐［梯希爱(上海)化成工业发展有限公司］;其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。快速薄层色谱(instant thin-layer chromatography, iTLC)-SG色谱纸(美国安捷伦科技有限公司)；DNA损伤检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；细胞增殖核抗原Ki-67抗体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗体［艾博抗(上海)贸易有限公司］；水溶性聚苯乙烯(polystyrene, PS)纳米粒子［中科雷鸣(北京)科技有限公司］。实验仪器：iTLC扫描仪(美国BioScan公司)；小动物活体成像系统(美国PerkinElmer公司)；动态光散射仪(dynamic light scattering, DLS;英国马尔文仪器有限公司)；透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM;美国FEI公司)。

2.细胞株与实验动物。小鼠乳腺癌细胞株4T1-luc购于上海酶研生物科技有限公司；雌性BALB/c裸鼠35只，4～6周龄，体质量(20±2)g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，均在无特殊病原体(specific-pathogen free, SPF)环境饲养。所有动物实验经江苏省原子医学研究所伦理委员会批准(JSINM-2023-032)，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2019-0025。

1. LMND@HG的制备。配体HG的合成参考文献［9］进行。过程简述如下：胱胺二盐酸盐(6.756 g, 30.0 mmol)和丙烯酰氯(6.336 g, 70.0 mmol)反应后得到白色粉末N,N′-双(丙烯酰)胱胺，与MBA、AEPZ通过迈克尔加成反应得到产物后，将1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐连接至产物的氨基得到超支化聚合物HG，作为稳定LMND的配体。

将5 mg超支化聚合物HG溶于12 ml去离子水中，放置于50 ml离心管，后加入80 μl LM原液，在冰浴中超声12 min（超声条件：功率500 W，频率20 kHz，振幅35%）。室温下将超声后的悬液以1 000 r/min离心5 min(离心半径5 cm)，弃底部大颗粒沉淀，得到均一的超支化聚合物修饰的LMND@HG悬液。连续7 d测定其水合粒径与电势，观察LMND@HG的稳定性。

2. ¹⁷⁷Lu-LMND@HG的制备。取7.40 MBq ¹⁷⁷LuCl₃加入 50 μl 0.05 mol/L HCl 进行稀释处理调节pH值至6，加入200μl LMND@HG于37 ℃反应4 h。使用0.1 mol/L柠檬酸钠溶液作为展开剂，采用iTLC进行¹⁷⁷Lu-LMND@HG的放射化学分析。

3. ¹⁷⁷Lu-PS的制备。将末端带有NH2的PS与1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NOTA)-N-氯代丁二酰亚胺(N-chlorosuccinimide, NCS)在二甲基亚砜中反应过夜，超滤纯化后使用纯水重悬，在其中加入7.40 MBq ¹⁷⁷LuCl₃，调节pH值至6，于65 ℃反应30 min。使用0.1 mol/L柠檬酸钠溶液作为展开剂，采用iTLC进行¹⁷⁷Lu-PS的放射化学分析。

4.体外稳定性研究。取100 μl ¹⁷⁷Lu-LMND@HG(7.40 MBq)与1 ml血浆混合均匀，于37 ℃振荡温育，于特定的时间取出混合溶液，使用0.1 mol/L柠檬酸钠溶液作为展开剂行iTLC测定¹⁷⁷Lu-LMND@HG的血浆稳定性。

5.细胞杀伤实验。为了探索LMND@HG的放疗增敏效果，本研究通过噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT)实验进行细胞水平的毒性研究，¹⁷⁷Lu-PS作为对照组。将4T1细胞消化后使用培养基重悬，铺于96孔板中，于细胞培养箱中过夜培养。待细胞稳定贴壁后，除去原有培养基，分别加入5 mg/L (111 kBq)、10 mg/L (222 kBq)、20 mg/L (444 kBq)和40 mg/L (888 kBq)的¹⁷⁷Lu-LMND@HG，对应相同剂量的¹⁷⁷LuCl₃、¹⁷⁷Lu-PS和相同质量浓度的LMND@HG。温育24 h后，通过MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒进行细胞毒性的测定。

6.移植瘤模型的构建。于37 ℃ 体积分数5% CO2恒温培养箱培养4T1细胞，待细胞生长至对数生长期，使用常规细胞培养方法收集细胞悬液，将1×106个细胞皮下接种于雌性BALB/c裸鼠右臀部，于SPF级动物房中正常饲养。肿瘤体积的计算方式为(长径×短径2)/2，肿瘤体积达100 mm³左右时作为治疗起点。

7.生物分布实验。为了更好地选择给药方式，通过尾静脉注射或瘤体注射¹⁷⁷Lu-LMND@HG到裸鼠体内(每组5只)，于5 d后进行解剖，取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤、骨骼、关节和肌肉等脏器，使用精密天平测质量，后经γ计数器测定放射性计数，计算获得¹⁷⁷Lu-LMND@HG在不同脏器中的每克组织百分注射剂量率(percentage activity of injection dose per gram of tissue, %ID/g)。

8.体内抗肿瘤研究。将25只4T1荷瘤鼠按随机数字表法分为5组（每组5只），分别为生理盐水对照组、1.48 MBq ¹⁷⁷LuCl₃治疗组、3.70 MBq ¹⁷⁷LuCl₃治疗组、1.48 MBq ¹⁷⁷Lu-LMND@HG治疗组、3.70 MBq ¹⁷⁷Lu-LMND@HG治疗组。通过瘤体单次注射的方式对荷瘤小鼠进行治疗，每隔2 d进行肿瘤体积的测量，绘制肿瘤生长曲线。

9.小动物活体光学成像。本研究选用的细胞株为4T1-luc，携带荧光素酶报告基因，可通过活体光学成像系统进行活体成像，分别于治疗后0、3、6、8、10 d进行活体成像。方法为裸鼠腹腔注射15 g/L的D-荧光素钾盐200 μl，注射后15 min进行活体成像，每组选择3只裸鼠。

10.病理学实验。在治疗结束后，将裸鼠进行解剖，取其肿瘤、心、肝、脾、肺、肾等器官放于组织固定液中，随后进行脱水、透明、浸蜡和包埋制成组织蜡块，使用石蜡切片机切片，厚度为5μm，进行HE染色，使用DNA损伤检测试剂盒(γ-H2AX免疫荧光法)进行免疫荧光染色，使用Ki-67、VEGF抗体进行免疫组织化学实验。

11.统计学处理。使用Graphpad Prism 6软件进行分析，符合正态分布或近似正态分布的定量资料以±s表示，采用单因素方差、重复测量方差分析及最小显著差异t检验进行数据分析，P<0.05为差异有统计学意义。

1. LMND@HG的制备。经超声破碎法制得LMND@HG，DLS测试其水合粒径为(208.80±7.17) nm，多分散指数为0.113±0.010，zeta电势为(37.12±0.99) mV。通过TEM证明LMND@HG呈片状(图1A)。

2. ¹⁷⁷Lu-LMND@HG的制备及稳定性分析。采用iTLC证明本实验已成功制得¹⁷⁷Lu-LMND@HG，结构示意图如图1B所示，标记率95%以上，不需要进一步纯化，且与血浆混合温育5 d后放化纯仍＞95%，iTLC结果表明未发生明显的脱镥反应。

3.细胞毒性研究。结果显示888 kBq (40 mg/L)下¹⁷⁷Lu-LMND@HG、¹⁷⁷LuCl₃、LMND@HG、¹⁷⁷Lu-PS间细胞毒性的差异有统计学意义（F=77.81,P<0.001）,其中¹⁷⁷Lu-LMND@HG对4T1细胞具有明显的毒性，细胞存活率明显低于¹⁷⁷LuCl₃［(16.48±7.81)%与(85.77±8.87)%;t=11.73,P<0.001］与LMND@HG［(46.53±5.75)%；t=6.20,P<0.001］处理后的细胞存活率，而¹⁷⁷LuCl₃与¹⁷⁷Lu-PS的细胞毒性无明显差异［(85.77±8.87)%与(73.95±4.32)%；t=2.39,P=0.054］，表明LMND@HG在细胞水平具有放疗增敏作用。

4. ¹⁷⁷Lu-LMND@HG的生物分布研究。给药后5 d，尾静脉注射组探针主要分布于脾［(43.40±2.12) %ID/g］与肝脏［(1.41±0.63) %ID/g］，瘤体注射组探针主要分布于肿瘤组织［(8.09±0.60) %ID/g］。因此，在后续体内抗肿瘤研究中选择瘤体注射的方式。

5.体内抗肿瘤研究。瘤体注射给药后，肿瘤生长曲线表明¹⁷⁷LuCl₃治疗组与对照组相比具有一定的肿瘤抑制效果，但效果不明显。治疗后第11天，对照组、¹⁷⁷LuCl₃治疗组、¹⁷⁷Lu-LMND@HG治疗组间肿瘤体积的差异有统计学意义（F=18.55,P<0.001）,其中1.48 MBq ¹⁷⁷Lu-LMND@HG较相同剂量¹⁷⁷LuCl₃可明显抑制肿瘤生长［肿瘤体积：(222.66±97.70)与(789.13±245.04) mm³；t=4.29,P=0.005］(图2)。活体光学成像同样证实了这一结果(图3)。同时，HE染色结果显示不同治疗组均未见明显脏器损伤，表明该纳米颗粒具有良好的生物安全性。

6.抗肿瘤机制研究(图4)。γ-H2AX免疫荧光实验结果显示¹⁷⁷Lu-LMND@HG治疗组均出现绿色荧光，表明¹⁷⁷Lu-LMND@HG治疗组DNA发生双链断裂。Ki-67染色显示，¹⁷⁷Lu-LMND@HG给药明显降低了4T1肿瘤细胞的增殖，且肿瘤血管生成受到有效抑制，VEGF表达下调。

¹⁷⁷Lu是目前最常用于放疗的金属核素［10-11］。然而，单纯使用¹⁷⁷Lu治疗往往由于乏氧肿瘤微环境而疗效不佳，且对周围组织具有明显毒性及不良反应［12］。LM在细菌、细胞内可代谢产生高浓度的Ga3+离子和ROS，实现放疗增敏［5,7,13］。因此，本研究使用¹⁷⁷Lu对LMND进行放射性标记，采用瘤体注射的方式给药，成功抑制了肿瘤的生长，较相同剂量¹⁷⁷LuCl₃治疗具有明显的放疗增敏效果。

不同给药方式对药物的体内治疗效果差异明显［14］。本研究通过生物分布实验探索了2种给药方式5 d后¹⁷⁷Lu-LMND@HG在不同器官中的分布情况，在尾静脉给药方式的BALB/c裸鼠中，脾具有最高的放射性摄取值，高达(43.40±2.12) %ID/g，这是由于静脉注射纳米颗粒主要分布肝、脾，而持续照射使脾减小，质量减轻，计算得到的放射性摄取值过高［15］，表明游离¹⁷⁷Lu3+有较高的组织毒性。在后续实验设计中，应在设计时增加靶向基团，提高静脉给药时纳米颗粒在肿瘤部位的摄取［16］。瘤体给药的BALB/c裸鼠生物分布实验显示，¹⁷⁷Lu-LMND@HG在给药后5 d仍在肿瘤部位滞留。因此，在肿瘤抑制实验中，¹⁷⁷Lu-LMND@HG与等剂量¹⁷⁷LuCl₃相比具有明显的肿瘤抑制作用。¹⁷⁷LuCl₃疗效差的原因除缺少载体外，同时存在¹⁷⁷Lu3+外溢的问题，这不仅增加了组织毒性，同时降低了肿瘤部位的有效治疗剂量，进而影响治疗效果［3］。

近年来，大量无机金属纳米颗粒作为放疗增敏剂被广泛研究。这些纳米载体往往含有高原子序数元素，如金、钆、铋等，可吸收放射性核素产生的电离辐射，使辐射能在肿瘤内沉积从而增强治疗效果［17］。然而，高原子序数元素因在体内的长期滞留与毒性易引发安全风险，且连接放射性核素时往往需修饰螯合剂。因此，开发更具生物相容性的放疗增敏纳米制剂具有重要意义。LMND具有良好的生物相容性，可通过合金化作用实现金属核素的高效稳定标记，并产生ROS实现放疗增敏［5,18］，是理想的放疗增敏纳米材料。在后续实验设计中，可使用具有化疗作用的配体修饰LMND，实现放疗增敏-放化疗协同治疗。

¹⁷⁷Lu在衰变时可发射低能γ射线，可用于SPECT显像，通过图像分析可观察被标记物在体内的靶向性、分布、代谢及排泄行为［19-20］。本研究后续实验将补充通过SPECT显像技术观察纳米颗粒在体内分布情况。同时，¹⁷⁷Lu的长半衰期特性为活体示踪LMND的药代和长期毒性监测提供了便利，以期推动LM基纳米药物和(或)助剂的临床转化［21］。

综上，本研究成功制备了¹⁷⁷Lu-LMND@HG，制备方法高效便捷，产物稳定性高、在小鼠乳腺癌移植瘤模型中显示出明显的放疗增敏效果，对后续¹⁷⁷Lu活体示踪LMND具有指导意义。