提高作物的耐旱性和了解其潜在的分子机制一直是研究的热点。2024年9月13日，西南大学李金华教授团队和华中农业大学张俊红教授团队在Nature Communications上联合发表题为“A truncated B-box zinc finger transcription factor confers drought sensitivity in modern cultivated tomatoes”的研究论文。该研究揭示了BBX18-APX1模块在番茄响应干旱胁迫过程中的分子机制。
背景
植物的生长发育与环境的变化息息相关。非生物胁迫（如干旱、高温、低温、高盐浓度、重金属中毒等）是植物分布和生长的重要决定因素。其中干旱对土壤和植物的影响最为深远。预计气候变化将增加干旱事件的频率和严重程度，从而成为农业生产的关键制约因素。因此，通过利用新的生物技术工具，利用最优基因来加快作物抗旱性的遗传增强，探索和阐明植物抗旱的遗传基础和潜在的分子机制变得尤为重要。
B-box（BBX）蛋白家族是一类独特的锌指转录因子（TFs），其通过与基因启动子上的顺式作用元件结合，通过激活或抑制基因的转录，在植物生长发育和在非生物胁迫响应中起着关键作用。
番茄是全球重要的蔬菜作物，起源于南美洲安第斯山脉的干旱地区。通常情况下野生番茄表现出很强的抗旱性，然而，在人类驯化和自然变异下，大多数栽培番茄已经变得对干旱敏感。在本研究中，作者使用基因芯片分析来研究抗旱驯化，并鉴定了一个自然存在的BBX18突变体，该突变体参与番茄抗旱调控。并且BBX18蛋白被发现与APX1相互作用，并结合到APX1启动子的顺式作用元件来调节其基因表达。该研究揭示了抗旱性调控的分子机制，为研究其他植物的抗旱性提供了思路。
结果
1、BBX18中的SNP-265是转录激活活性的关键SNP位点
在之前的研究中，作者以干旱敏感品种M82为轮回亲本创制的番茄基因渐渗系群体中鉴定了两个耐旱渗入系（IL2-5和IL9-1）。作者认为，干旱胁迫下在耐干旱系中差异表达的基因可能是由于插入的两个染色体片段含有耐旱数量性状位点（QTLs）。对这些差异表达基因（DEGs）的分析中发现，SlBBX18在干旱胁迫下与M82和IL9-1相比，在IL2-5中的表达显著降低。SlBBX18位于番茄基因组的2号染色体，其两翼存在RFLP标记。此外，BBX18被BAC克隆定位于染色体2-I中的IL片段，这些证据都表明了SlBBX18是一个主要的抗旱性QTL。为了研究其在干旱胁迫响应中的作用，作者克隆了M82（SlBBX18）和潘那利番茄LA0716（SpBBX18）中BBX18的全长CDS，SlBBX18与SpBBX18序列具有显著的相似性，同源性达99.6%。值得注意的是，仅存在SNP-265和SNP-328两个突变（图1a）。有趣是，SlBBX18第265位的T变异由于引入终止密码子（TGA）而导致翻译过早终止，而第328位的变异导致氨基酸替换。
为了提供SlBBX18和SpBBX18转录因子功能的支持证据，首先作者通过亚细胞定位发现SlBBX18和SpBBX18都主要定位于细胞核（图1c），这与其作为转录因子的功能是一致的。随后，作者在酵母转录激活实验中发现SlBBX18在酵母中起转录激活的作用，而SpBBX18不表现出这种功能，并且这种转录激活活性由SlBBX18的N端决定（图1b）。值得注意的是，在SlBBX18和SpBBX18序列之间鉴定了两个SNP。为了确定负责转录激活的SNP位点，作者采用了基于PCR的位点定向诱变。结果显示，pBD-SpBBX18-C265T表现出转录激活，而pBD-SpBBX18-C328T没有导致转录激活（图1d）。这些结果表明SlBBX18和SpBBX18表现出明显的差异。为了研究SlBBX18和SpBBX18在植物转录调控中的作用，作者构建了具有Gal4 DNA结合域（DBD）的SlBBX18和SpBBX18全长重组融合蛋白。通过注射烟草发现，与对照相比，SlBBX18的LUC活性显著升高，而SpBBX18的LUC活性显著降低（图1e）。这证实了转录活性是由SlBBX18而不是SpBBX18特异性赋予的。此外，作者还发现了BBX18中的SNP-265是转录激活活性的关键SNP位点。
2、抗旱性和BBX18等位基因在番茄进化过程中呈负向选择
SNP-265的C-to-T改变引入了一个终止密码子（TAG），导致BBX18基因的过早翻译终止，这似乎是BBX18的关键SNP。作者对321份番茄种质资源进行了BBX18 SNP分析，其中53份为PIM，108份为CER和160份BIG（图2a）。其中，CER代表来自PIM的驯化谱系，而BIG代表来自CER的改良谱系。大约98%的野生番茄和69%的早期驯化番茄表现出BBX18CC等位基因的纯合子性，而只有28%的栽培番茄表现出BBX18CC的纯合子性，其中67%为BBX18CC等位基因的纯合子性（图2a）。随后，对BBX18变异的分析表明，BBX18位点在候选番茄驯化清除中没有被选择（图2b）。
为了研究BBX18在栽培番茄中的作用，我们评估了BBX18等位基因变异对干旱的影响。在干旱处理后，PIM组观察到的平均成活率显著高于CER和BIG组，这表明在番茄驯化过程中，抗旱性状可能更受青睐（图2c）。此外，与BBX18TT基因型相比，带有BBX18CC基因型的番茄表现出显著更高的成活率（图2d）。因此，这些结果表明，BBX18在番茄进化过程中受到了自然选择的影响。
3、BBX18负调控番茄抗旱性
在M82和潘那利番茄的组织表达中发现，BBX18主要在植物的地上组织中显著表达，尤其是在茎、叶和花中。此外，在不同非生物胁迫（盐、干旱、甲基紫素（MV））和ABA激素处理下，BBX18的表达量在0.5 h迅速下降，然而，此后观察到连续诱导。值得注意的是，BBX18的表达量在M82中6 h达到最高，潘那利番茄中1 h达到最高。这些结果暗示着，BBX18在非生物胁迫响应中起着初始负调节作用，也强调了两种基因型之间不同的表达模式。
为了研究BBX18在番茄抗旱性调控中的作用，作者得到了SpBBX18-OE、SlBBX18-RNAi和SlBBX18-CR转基因株系。通过干旱处理7天后发现，RNAi和CR敲除系的番茄植株抗旱性显著提高，而OE系的植株对干旱胁迫更加敏感（图3a-b）。通过田间实验也发现bbx18突变体株系在缺水条件下产量高于WT。这些结果表明，BBX18负调控番茄抗旱性。
为了进一步研究BBX18不同表达水平诱导的生理生化变化，作者定量测定了脯氨酸（Pro）、ASA的含量以及几种抗氧化相关酶的活性。结果发现，在bbx18系中敲除BBX18后，转基因植物在干旱胁迫下POD、CAT和APX酶活性增强。干旱胁迫下CR系脯氨酸和ASA含量显著升高。而Pro和ASA含量的增加，以及抗氧化酶活性水平的改变，最终导致CR系转基因植株抗缺水能力的提高。
4、BBX18与抗坏血酸过氧化物酶1（APX1）相互作用
为了阐明BBX18抗旱性的分子机制，作者利用SpBBX18全长蛋白，通过质谱（IP-MS）和酵母双杂交（Y2H）筛选相互作用的蛋白伴侣，通过STRING数据库验证这些相互作用。IP-MS分析发现269种可能与BBX18相互作用的蛋白，Y2H筛库发现270个与BBX18相互作用的蛋白（图4）。功能富集分析表明，这些基因主要与溶质转运、氧化还原稳态、转录因子、光合作用以及转录和转录后调控有关。特别令人感兴趣的是BBX18和APX1之间的相互作用，因为这种相互作用在IP-MS和Y2H分析中都被检测到。
作者为了进一步证实BBX18与APX1之间的相互作用，利用双分子荧光互补（BiFC）、酵母双杂、共免疫沉淀（Co-IP）实验来进行验证。结果发现，SlAPX1与SlBBX18或SpBBX18的相互作用都是通过SlBBX18和SpBBX18蛋白共享的N端双B-box结构域特异性发生的，而BBX18的C端CCT结构域并不会相互作用（图5）。
5、BBX18直接负向调控APX1的表达
作为一种转录激活因子，BBX18可能与下游基因的启动子结合。为了确定BBX18启动子的潜在结合位点，作者通过ChIP-Seq发现可能与一些顺式作用原件结合：GGRCCM（C1），CACDTG（C2），GAAARWGA（C3），ATTTAWT（C4）（图6a），共鉴定出1033个受BBX18调控的潜在靶基因。GO富集分析发现这些靶基因大多参与DNA结合和转录调控，而其他靶基因则参与各种调控途径，这也暗示着BBX18在植物中的关键功能（图6）。
为了进一步研究BBX18的作用机制，我们对BBX18-OE、BBX18-RNAi和野生型植物进行了RNA-Seq。在正常生长条件下，BBX18-OE或BBX18-RNAi与WT之间的差异表达基因较少。然而，在干旱处理之后，DEGs的丰度显著增加。富集分析表明，干旱处理后，这些DEGs大多富集在次生代谢物的生物合成、类黄酮的生物合成、抗坏血酸和醛酸盐的代谢以及过氧化物酶体的代谢途径中。此外，通过将ChIP-Seq数据与RNA-seq分析相结合，作者发现APX1和BBX基因（如BBX3和BBX24）是BBX18的潜在靶点（图6c）。ChIP-qPCR分析证实在APX1、BBX3和BBX24中存在BBX18结合峰（图6d）。这些结果暗示着BBX18可能在调节BBX基因家族的表达，特别是APX1的表达中发挥作用。
作者发现在SlAPX1启动子序列中有两个C3基序。为了确认BBX18是否可以直接结合SlAPX1启动子，通过酵母单杂交（Y1H）实验。研究结果表明，SlBBX18-C、SpBBX18和SpBBX18-C可以结合SlAPX1的-1222 bp启动子（图7a-d）。为了进一步研究BBX18和BBX18片段的两种突变是否会影响SlAPX1的激活，作者将SlAPX1的启动子截断通过双荧光素酶报告基因试验中用于驱动LUC报告基因的表达（图7a-b）。结果表明，SlAPX1的启动子是SlBBX18的靶点，SlAPX1启动子中的C3基序可能是BBX18-C的特异性顺式元件（图7c）。为了进一步验证这些发现，作者用EMSA证实了BBX18与C3基序的特异性（图7d）。以上实验都证明了BBX18的C端是与APX1启动子的C3顺式作用元件结合的蛋白质结构域。
6、SlAPX1正调控番茄抗旱性，受BBX18调控
之前的研究已经证实了BBX18不仅在蛋白水平上与APX1相互作用，而且还与APX1基因启动子中的顺式作用元件结合，调节APX1基因的表达。为了进一步研究SlAPX1的功能，作者成功获得了过表达和敲除转基因植株。转基因植株表型观察中发现：SlAPX1基因的过表达通过调节酶的活性导致植物代谢反应的增强，最终导致番茄植株抗旱性的提高。
为了进一步研究BBX18与APX1在植物抗旱性中的遗传互作及其调控关系，作者利用BBX18植株、APX1过表达植株（APX1）和APX1敲除植株（apx1）进行了遗传杂交实验。利用PCR和测序验证对F2植株进行了基因分型，并成功鉴定出同时携带纯合子bbx18、APX1和apx1位点的植株。通过甘露醇处理，将所选品系的植株置于模拟干旱条件下。结果表明，bbx18/APX1-OE植株与bbx18植株的抗旱性无显著差异，但抗旱性显著高于APX1-OE植株，而APX1-OE植株的抗旱性显著高于野生型对照植株（图8a-b）。对不同品系的植株进行暂不给水的干旱处理，得到了相似的结果（图8c）。bbx18/APX1和bbx18植株的存活率高于APX1-OE植株和WT植株（图8d）。与bbx18和野生型对照相比，bbx18/APX1和APX1-OE植株中APX1基因的表达和APX酶的活性均有所升高。而APX1在bbx18和野生型对照中的表达无显著差异，说明敲除SlBBX18不影响APX1的表达。然而，bbx18/APX1和bbx18植株的APX酶活性显著高于APX1-OE植株（图8e）。这一证据支持BBX18对APX1的调控作用。以上这些结果表明了SlBBX18调节APX酶的活性，但不影响APX1基因的表达。
通过以上结论，作者提出了一种在番茄植株中BBX18与APX1相互作用调控番茄抗旱性和干旱敏感性的模型机制（图9）。野生番茄（Solanum pennellii）之所以比栽培番茄（S. lycopersicum）更耐干旱，其原因主要是来自野生番茄的BBX18基因（SpBBX18）编码全长转录因子，而来自栽培番茄的同源基因（SlBBX18）在265位有一个核苷酸突变导致过早形成终止密码子（TAG），并导致BBX18 N端截断蛋白的合成。SpBBX18的C端具有抑制APX1基因表达的转录抑制活性。在野生番茄中，SpBBX18结合APX1启动子中的两个串联C3顺式元件（GAAARWGA）并抑制其基因表达。在栽培番茄中，SlBBX18是一个截断蛋白，其N端一半具有双B-box结构域，但缺乏C端不具有转录抑制活性，允许APX1正常表达。SlBBX18的N端与APX1的相互作用降低了其抗坏血酸过氧化物酶活性，从而使栽培番茄对干旱胁迫敏感。
总结
提高作物的耐旱性和了解潜在的机制一直是研究的热点。在这里，作者报道了BBX18的一个天然等位基因（BBX18TT），它编码一个C端截断蛋白。大多数野生番茄种质含有BBX18CC等位基因，具有较强的耐旱性，而现代栽培番茄大多携带BBX18TT等位基因，对干旱更敏感。敲除BBX18基因可提高栽培番茄转基因植株的抗旱性。抗坏血酸过氧化物酶1（APX1）是一种与BBX18相互作用的蛋白，在番茄抗旱性中起正向调节作用。此外，还提出了BBX18-APX1模块介导植物抗旱性的分子机制。该研究揭示了抗旱性调控的机制，为研究其他植物的抗旱性提供了一定的思路。
评论人：龙涛
修改人：曾新颖
编辑人：赵智鹏
