Plant cell | OsKANADI1和OsYABBY5通过靶向OsGA2ox6调节水稻植株高度

作物株高，以水稻为例是指从地面到穗的高度，主要由茎的长度来决定，是作物改良最重要的性状之一。第一次绿色革命就是以半矮化农作物的出现而开始。粮食安全是立民之本，强国之基，提升作物品质与产量有利于保障国家的粮食安全，促进农业可持续发展，提高国民幸福指数。研究植物株高的调控机制可以指导育种学家在选育过程中对特定基因进行有效利用，培育出具有抗倒伏，高收获指数的品种。株高由复杂的分子网络所调控，尤其与赤霉素、生长素以及油菜素内酯等植物激素紧密相关。特别是对赤霉素通路关键基因的挖掘，打开了水稻抗倒伏研究的一个又一个宝藏。

近日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所汪泉课题组在植物领域顶级期刊The Plant Cell 发表了题为“OsKANADI1 and OsYABBY5 regulate rice plant height by targeting  GIBERELLIN 2-OXIDASE6” 的研究论文，揭示了一个由OsKAN1、OsYAB5和OsGA2ox6组成的全新调控模块共同调控水稻株高，为作物的株型改良提供了新的分子机制和候选基因。

1. OsKAN1影响了水稻株高和节间伸长

本故事的开始来源于一株稻田中存在自然变异的水稻株系，该株系具有半矮化和叶片卷曲的表型（图1.A-C）。图位克隆显示，该基因位于第九号染色体上，初步靶定为OsKANADI1（OsKAN1）（图1.D）。Oskan1突变体与现有研究中sll1突变体一致，都具有叶片卷曲的表型。杂交后F1的表型类似于两个亲本，证实oskan1和sll1突变体的等效基因是等位基因，并且oskan1的表型是由于SLL1基因的缺失所致。而在oskan1突变体中过表达OsKAN1后，半矮化和叶片卷曲的表型恢复正常。表型分析显示，oskan1突变体在整个发育阶段，从苗期到成熟期都表现出半矮化表型，可能归因于节间伸长的缺陷。为进一步探究oskan1植物半矮化表型的原因，作者对一个月大的幼苗叶鞘进行了细胞学观察。结果显示，oskan1植物的叶鞘细胞在苗期比TP309植物小40%（图1.J,K）。外源施加赤霉素可以回补oskan1的表型，因此作者推测oskan1植物的矮化表型可能是由于较低的赤霉素水平，具体表现为细胞伸长减少和植物高度的降低。

为进一步检查OsKAN1对植物高度的影响，作者在Nip背景下构建proUbi:OsKAN1转基因植物来分析OsKAN1过表达植物的表型。结果显示，过表达株系在生殖期比Nip株系高14%（图2.A,B），同时，过表达株系的节间伸长也比Nip植物更大，且穗节间显著更长图（2.C,D）。这些发现进一步支持了OsKAN1通过影响节间伸长来影响植物高度的结论。此外，过表达株系的穗具有较长的芒（图2.E）。同时，过表达株系苗期的第二叶鞘和第二叶鞘表皮细胞的长度均显著长于Nip（图2.F-I）。原位杂交，GUS染色与蛋白表达WB（Western blot）等实验均表明OsKAN1在多组织中差异表达，包括穗节、茎节、节间、叶片和根组织等（图2.J-L），进一步证实了OsKAN1可能在水稻节间伸长和株高调控具有重要作用。

FIG.1 Oskan1突变体的表型分析及基因鉴定

FIG.2 OsKAN1对水稻生长的影响及组织表达分析

2. OsKAN1与OsYAB5互作

为鉴定候选蛋白OsKAN1的相互作用蛋白，作者进行了酵母双杂的文库筛选。分析显示，OsYABBY5（OsYAB5）被鉴定为OsKAN1相互作用蛋白之一。现有研究显示，OsYAB5基因的突变导致小穗的外颖和内颖异常发育，还诱导了小穗芒的伸长，这与proUbi:OsKAN1植株表型相似。重要的是研究表明，OsYAB1、OsYAB4和OsYAB5的过表达也被证明会影响水稻的植株高度。因此，OsYAB5被选为研究OsKAN1对植物高度发育调控机制的候选基因。

紧接着作者进行了多种体外和体内实验验证文库筛选的结果。在酵母双杂交(Y2H)实验显示，包含C2C2结构域的OsYAB5N对于与OsKAN1的相互作用至关重要。C2C2结构域是一种锌指结构域，能够与DNA结合并调节下游基因的表达。免疫共沉淀（Co-IP）实验显示，OsKAN1和OsYAB5在水稻原生质体中表现出强烈的相互作用（图3.C）。同时pull-down实验和BiFC实验也证明了他们体内外的互作（图3.D,E）。

OsYAB5-GUS株系的组织表达分析结果显示，在叶片、叶鞘、叶脉关节和小穗中均可检测到GUS活性。值得注意的是，OsYAB5在生殖阶段的穗节点和茎节点特异性表达，但不在节间中表达（图3.K）。作者还使用OsYAB5抗体确定了Nip中OsYAB5的蛋白水平（图3.L），结果显示在四周大的叶片和叶鞘中检测到OsYAB5，并且在节点中检测到OsYAB5，但在节间中没有检测到，与GUS结果一致。

FIG.3 OsKAN1与OsYAB5互作鉴定

3.OsKAN1抑制OsYAB5转录，该抑制作用可被OsKAN1-OsYAB5复合体恢复

基于OsKAN1和OsYAB5均编码转录因子，作者首先研究了OsKAN1和OsYAB5是否通过转录机制来相互调控。作者通过对野生型和oskan1突变体的RNA-seq分析发现在oskan1突变植株中OsYAB5表达量显著上升，暗示了OsKAN1可能抑制了OsYAB5的转录。作者通过LUC实验对该机制进行了证实，但有意思的是，当同时表达OsYAB5时，proOsYAB5 的LUC信号显著增强，说明OsKAN1-OsYAB5复合体恢复了OsKAN1对OsYAB5的转录抑制。作者进一步通过ChIP-qPCR、EMSA以及原位杂交等体内外蛋白-DNA互作实验验证了OsKAN1可以与OsYAB5启动子结合。值得注意的是ChIP-qPCR和EMSA实验共同证明OsKAN1显著结合在OsYAB5启动子的P2 DNA片段上（包含RGAATAWW保守基序）（图4）。

FIG.4 OsKAN1负调控OsYAB5的表达

4.OsYAB5调控水稻植株高度

为研究OsYAB5对水稻植株高度的潜在影响，作者首先构建了过表达株系。该转基因植物表现出半矮化或矮化表型（图5.A,B）。同时有些过表达Line在抽穗期似乎没有小穗（图5.A右侧）。进一步表型挖掘显示，鞘内存在隐藏的穗，可能由于节间挤压而缩在茎的基部（图5.C,D）。过表达株系的节间在生殖阶段比野生型短19%（图5.E,F）。此外，过表达株系幼苗在五叶期的高度比野生型幼苗短，其叶片聚集形成扇形框架（图5.G），这表明转基因株系的叶鞘的生长可能异常。随后作者同样确定了添加GA3可以恢复pro35S:OsYAB5过表达植物的矮化表型。额外的是，作者还发现pro35S:OsYAB5植物的节点和节间的OsKAN1转录水平降低，这表明OsKAN1和OsYAB5可能在水稻中相互抑制了对方的表达。此外，作者在Nip背景下生成了两个独立的OsYAB5 CRISPR系（osyab5-cri #1和#2）。表型特征分析显示，#1和#2植物显著高于野生型（WT）植物。由于两个CRISPR系的生物学特性基本相似，作者在后续实验中使用了#1系（osyab5-cri）。结果显示，osyab5-cri植物在生殖阶段比WT植物高出近12%，并且节间伸长也大于WT（图5.L,M）。有趣的是，osyab5-cri植物的穗产生了长芒，类似于proUbi:OsKAN1植物（图2.E）。此外，osyab5-cri的第二叶在苗期出现皱褶，这也与proUbi:OsKAN1植物相似。Pro35S:OsYAB5植物的表皮细胞显著短于WT幼苗，而osyab5-cri幼苗的叶鞘与WT植物相比显著延长（图5.P,Q）。以上结果共同表明OsYAB5的过表达导致半矮化或矮化表型，而OsYAB5的敲除则产生了相反的效果。

FIG.5 OsYAB5调控水稻株高

5.OsYAB5结合到OsGA2ox6启动子上以激活其转录

为研究OsYAB5在植物高度调控中的调节途径，作者对半矮化和矮化的pro35S:OsYAB5和Nip植物进行了RNA-seq分析。分析显示，除OsGA20ox2和OsGA20ox5外，参与GA生物合成的基因没有显著变化，但编码GA代谢酶的几个基因表达发生了显著变化（图6.B）。OsGA2ox6和OsGA2ox9在半矮化的pro35S:OsYAB5植物中显著上调，OsGA2ox6的表达在半矮化和矮化的pro35S:OsYAB5植物中都很显著。因此，作者紧接着验证OsYAB5是否能直接调控OsGA2ox6的表达。LUC实验表明OsYAB5能够激活OsGA2ox6的转录（图6.C,D）。然而，当OsKAN1和OsYAB5共同转时，对OsGA2ox6的激活消失了。分析结果显示，OsGA2ox6的启动子区域存在几个潜在的YABBY结合位点。ChIP-qPCR实验显示，OsYAB5可以在体内结合到OsGA2ox6启动子的P2 DNA片段（图6.E,F）。作者进一步使用EMSA实验确定OsYAB5结合在OsGA2ox6启动子的P2区域,而OsKAN1-OsYAB5两个蛋白同时存在时抑制了这种结合（图6.G）。

研究表明，OsGA2ox6的过表达导致了水稻植物的超矮化。接下来作者同样证明了敲除OsGA2ox6能使水稻的植株更高。此外一些列实验证明OsKAN1、OsYAB5和OsGA2ox6存在不同的表达模式。在节点中，OsGA2ox6的转录水平显著高于节间，这与OsYAB5的观察结果一致，表明OsYAB5主要在节点中激活OsGA2ox6。

FIG.6 OsYAB5激活OsGAox6的转录表达

6.OsKAN1–OsYAB5复合体在水稻植株高度中扮演重要角色

如图4和图6所示，OsKAN1抑制了OsYAB5的表达，而OsYAB5激活了OsGA2ox6。同时，OsKAN1和OsYAB5形成复合物时，这种抑制和激活作用消失。为进一步探究OsKAN1–OsYAB5复合物的生物学作用，作者在Nip背景下构建了OsKAN1启动子驱动的OsYAB5（proOsKAN1:OsYAB5）转基因株系。在proOsKAN1:OsYAB5植株的分生组织中的原位杂交结果显示，OsYAB5 mRNA在叶片的下表面积累增多。在生殖阶段，proOsKAN1:OsYAB5植株显著高于WT植株（图7.A,B），其节间伸长也比WT植株大（图7.C,D）。此外，proOsKAN1:OsYAB5植株的颖花具有长芒（图7.C）。在幼苗阶段，其高度几乎是WT植株的两倍（图7.E,F）。ProOsKAN1:OsYAB5的第二鞘的表皮细胞比Nip植株的更长（图7，G和H）。以上结果都证明了在OsKAN1启动子下异位表达OsYAB5可能会在植物中形成一个异常的OsKAN1–OsYAB5复合物，从而增加水稻的植株高度。如图6F所示，OsKAN1–OsYAB5复合物的形成抑制了对OsGA2ox6的激活。ProOsKAN1:OsYAB5节间的RNA-seq数据也揭示了一些GA代谢基因被下调，其中包括OsGA2ox6。

为了确认OsKAN1–OsYAB5复合物的重要性，作者在proOsKAN1:OsYAB5植株中清除掉OsKAN1的表达。作者将proOsKAN1:OsYAB5和oskan1植株杂交，在F2代中获得了缺乏OsKAN1的oskan1 pOsKAN1:OsYAB5植株。有趣的是，oskan1 proOsKAN1:OsYAB5植株在所有发育阶段都严重矮化（图7.I）。同时oskan1 proOsKAN1:OsYAB5植株的细胞伸长显著减少，导致了矮化表型。这种矮化表型可能是由于OsGA2ox6的强烈上调。此外，作者将oskan1 proOsKAN1:OsYAB5植株进行外源GA3处理后，该株系的矮化表型得到恢复，这表明

oskan1 proOsKAN1:OsYAB5植株对GA3比oskan1单突变体更敏感（图7.L,N）。RT-qPCR分析显示，与WT植株相比，oskan1 proOsKAN1:OsYAB5植株中OsKAN1的表达水平降低，而OsYAB5和OsGA2ox6的表达水平增加。总之，oskan1 proOsKAN1:OsYAB5和proOsKAN1:OsYAB5植株之间的极端植株高度差异证明了OsKAN1–OsYAB5复合物的重要影响。

FIG.7 OsKAN1–OsYAB5复合体对表型的复杂调控

7.OsKAN1和OsYAB5参与了赤霉素的反馈调节

随后作者确定了OsKAN1和OsYAB5是否参与赤霉素（GA）反馈机制。RT-qPCR分析显示野生型中OsKAN1的转录水平在GA3处理后迅速增加，在处理后2小时达到峰值，之后急剧下降。而OsYAB5的转录水平在添加GA3后急剧下降，在处理后0.5小时下降了60%。有趣的是，GA3处理降低了OsGA2ox6的转录，与现有其他研究一致。总之，作者表明GA水平也能影响水稻中OsKAN1和OsYAB5的表达水平。

8.赤霉素（GA）和细长稻1（SLR1）的积累在不同的遗传背景下发生了改变

植物的节间部经历伸长过程，并极大地影响植物的高度。为了确定GA水平是否改变并影响节间部的伸长，作者检测了节间的GA水平。结果显示，与Nip植物相比，osyab5-cri和proOsKAN1:OsYAB5植物的节间部中生物活性GA1和GA4的水平显著增加（图8.A,B）。此外，与Nip植物相比，proUbi:OsKAN1植物的节间部中GA1和GA4的水平显著增加，pro35S:OsYAB5植物的节间部中GA1和GA4的水平下降（图8.A,B）。RT-qPCR数据显示，oskan1节间部中CYP714B1和CYP714B2的转录水平下降，这表明GA1和GA4的不同趋势可能是由于GA 13-氧化酶途径所致。

研究显示，SLR1编码一个GA信号传导的负调节因子DELLA蛋白。SLR1的积累或降解与节间部的伸长密切相关。在GA水平高的情况下，SLR1迅速降解，导致蛋白质水平降低；相反，在GA水平低的情况下，SLR1的降解减慢，蛋白质水平保持相对较高。作者在抽穗阶段检测了这些植物节间部的SLR1蛋白水平。在节间（图8E），oskan1的SLR1水平相比野生型显著增加，尽管oskan1节间部的GA4水平高于TP309，但增加的SLR1蛋白水平表明oskan1节间部的总生物活性GA水平可能已经降低。ProUbi:OsKAN1、osyab5-cri和proOsKAN1:OsYAB5节间部的SLR1蛋白水平下降，但在pro35S:OsYAB5中增加。最重要的是，在oskan1 proOsKAN1:OsYAB5节间部中积累了大量的SLR1。此外，作者还检测了幼苗中GA1和GA4的水平。结果显示，pro35S:OsYAB5植物中GA1和GA4的水平显著下降。在osyab5-cri植物中，GA1和GA4显著增加。这些发现证实了OsYAB5激活了OsGA2ox6的表达，这反过来又改变了植物中生物活性GAs的水平。proOsKAN1:OsYAB5植物中GA1和GA4的水平都显著增加。Oskan1植物中GA4的水平降低，而proUbi:OsKAN1植物中GA1的水平显著增加。这些结果证实了OsKAN1和OsYAB5通过改变生物活性GAs的水平来影响幼苗的高度。

FIG.8 OsKAN1-OsYAB5-OsGA2ox6在节点和节间调控赤霉素的分子模型

综上所述，该研究阐明了OsKAN1、OsYAB5和OsGA2ox6的调控模块，通过转录和蛋白水平调节水稻株高。OsKAN1和OsYAB5在节和节间中的相互作用调控了生物活性GAs的空间分布，从而影响水稻茎的生长发育。OsKAN1-OsYAB5-OsGA2ox6调控通路的揭示有助于理解水稻茎伸长的分子基础，为具有理想高度的水稻育种提供了潜在资源。