2024年10月30日，华中农业大学程家森团队在Nature Communications 在线发表了一篇题为“An effector essential for
virulence of necrotrophic fungi targets plant HIRs to inhibit host immunity”的研究论文，该研究鉴定了一个核盘菌效应子SsPEIE1，并揭示了其抑制宿主免疫的分子机制。
核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种毁灭性子囊菌，寄主广泛，可侵染700多种植物，包括油菜、大豆、向日葵、甜菜和莴苣等重要经济作物，对多种作物造成严重的产量损失和经济损失。植物病原菌常通过分泌效应子来增强其对植物的侵染。在核盘菌中，一种名为SsPEIE1的分泌蛋白在其致病过程中起着至关重要的作用，但其抑制宿主免疫的分子机制并不清楚。分泌蛋白SsPEIE1对核盘菌的完全毒力起着至关重要的作用研究者通过转录组分析发现SsPEIE1在核盘菌侵染过程中显著上调表达。系统发育分析表明，SsPEIE1的同源基因在坏死营养型病原真菌中广泛存在，包括几种重要的植物病原真菌(图1a)，但SsPEIE1内部没有已知的功能域。SsPEIE1具有一个预测的信号肽（SP），通过酵母分泌实验验证其分泌功能（图1c, d）。RT-qPCR分析发现，接种拟南芥叶片后，SsPEIE1的转录水平迅速上升，在接种后6 h ( hpi )达到峰值，为对照的68倍(图1e )，而使用PDA培养基培养的核盘菌的SsPEIE1转录水平没有增加。为了进一步研究SsPEIE1对核盘菌致病力的贡献，研究者构建了两个SsPEIE1缺失突变体(ΔSsPEIE1-1和ΔSsPEIE1-2)及回补株(ΔSsPEIE1-1-C1和ΔSsPEIE1-1-C2)。两个ΔSsPEIE1突变体表现出与野生型菌株相似的生长速率、菌落形态和OA生产能力(图1f , g)，表明SsPEIE1不是正常生长所必需的，不影响OA的产生。接种实验发现，ΔSsPEIE1突变体在拟南芥叶片上引起的病斑明显小于野生型菌株(图1h, i)，与WT菌株相比，ΔSsPEIE1突变体也显示出更低的相对核盘菌生物量(图1j)。而回补株表现出恢复的毒力，其病斑面积与野生型菌株相当(图1h-j)。这些结果表明SsPEIE1是核盘菌完全毒力所必需的分泌蛋白。图1 分泌蛋白SsPEIE1在核盘菌致病过程中发挥重要作用表达SsPEIE1的转基因拟南芥对死体营养型病原菌的敏感性增加，免疫反应受到抑制为了研究SsPEIE1在植物-核盘菌互作中的作用，研究者构建了组成型表达SsPEIE1的转基因拟南芥。与野生型植株相比，SsPEIE1转基因株系表现出更小的叶面积。作者首先研究了SsPEIE1是否影响植物对核盘菌侵染的敏感性。与WT相比，SsPEIE1转基因植株表现出明显更大的病斑面积和更多的相对核盘菌生物量(图2a-c)。SsPEIE1转基因植株对另一种病原真菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)也表现出较高的敏感性(图2d-f)。在SsPEIE1转基因植株上接种ΔSsPEIE1突变体，ΔSsPEIE1突变体的致病力上升到野生型植株上接种WT核盘菌的水平(图2g-i )。与毒力表型一致，SsPEIE1转基因植株表现出由PAMPs几丁质或flg22 (图2j, k)触发的MAPK激活显著降低。此外，几丁质、flg22和核盘菌nlp20引发的ROS爆发在SsPEIE1转基因植株中受到显著抑制(图2l- n )。免疫标记基因FRK1、NHL10和PR1在几丁质处理的SsPEIE1转基因植株中也显示出较低的诱导水平(图2o )。综上所述，SsPEIE1转基因植株中的植物早期免疫反应受到强烈抑制，进一步凸显了SsPEIE1在核盘菌致病过程中的重要性。SsPEIE1与拟南芥超敏诱导反应4 ( AtHIR4 )在质膜上互作研究人员对拟南芥cDNA文库进行了酵母双杂交(Y2H)筛选，发现仅有6个猎物蛋白与SsPEIE1互作。由于SsPEIE1-GFP在本氏烟中定位于细胞膜和细胞质(图3a)，研究者重点关注与SsPEIE1亚细胞定位相似的猎物蛋白，拟南芥AtHIR4同时满足这两个标准。随后，研究者通过Y2H、split-LUC、Co-IP等实验证明SsPEIE1与AtHIR4互作(图3b-e)。AtHIR2和AtHIR4在抗死体营养型真菌中发挥重要作用为了探究AtHIR4在调控植物对核盘菌免疫反应中的作用，研究者构建了纯化的hir4突变体。AtHIR4在拟南芥中的功能缺失并不影响植物的形态和生长。然而，hir4突变体对核盘菌和灰葡萄孢 (图4a, d)的敏感性显著增加，病斑面积和相对真菌生物量增加了~ 50 % (图4b, c, e, f)，与SsPEIE1转基因植株相似。值得注意的是，ΔSsPEIE1突变菌株对hir4突变体植株的致病力得到了恢复(图4g-i )。这些结果表明SsPEIE1可能通过与At HIR4互作抑制植物免疫反应。为了进一步明确AtHIR2和AtHIR4在植物免疫中的生物学意义，研究者构建了hir2 / hir4双突变体拟南芥( hir24 )。接种实验发现，与野生型Col -0相比，突变体hir2、hir4和hir24表现出更快的病情发展和更高的核盘菌生物量(图4k-m )，表明AtHIR2和AtHIR4在调控对核盘菌的抗性中发挥重要作用。此外，ΔSsPEIE1突变菌株对hir24突变体植株的致病力恢复至WT菌株水平(图4n-p )。与SsPEIE1转基因植株的表型一致，hir2、hir4和hir24突变体也表现出受损的几丁质触发的MAPK激活和ROS爆发，特别是在hir24双突变体拟南芥(图4q, r)中。这些结果支持了AtHIR2和AtHIR4对植物早期免疫反应的重要性，进一步明确了SsPEIE1诱导的植物感病是通过靶向AtHIR2和AtHIR4实现的。图4 AtHIR2和AtHIR4在抗死体营养型真菌中发挥重要作用SsPEIE1竞争性结合AtHIR4并破坏其寡聚化能力和寡聚化介导的抗病性研究人员在Co-IP实验中发现AtHIR4可以形成同源寡聚蛋白质，但是在SsPEIE1存在的情况下，这种同源寡聚体的形成明显减少(图3d )。当AtHIR4和SsPEIE1在本氏烟中共表达时也观察到了同样的现象(图5a )。这些观察结果使研究人员推测AtHIR4可能发生同源寡聚化，而SsPEIE1可以与AtHIR4互作来削弱这一过程。为了进一步证实这一假设，研究者进行了体内和体外验证实验。首先，研究人员进行了酵母三杂交( Y3H )实验，结果表明SsPEIE1显著抑制AtHIR4自身互作(图5b )。为了确定SsPEIE1是否直接影响AtHIR4自相互作用，作者使用MBP、MBP-SsPEIE1、GST-AtHIR4和AtHIR4-His融合重组蛋白进行了体外pull - down实验。结果表明，AtHIR4与SsPEIE1在体外存在直接的相互作用，而且SsPEIE1以剂量依赖的方式抑制AtHIR4的自结合(图5c )。Co-IP实验发现，AtHIRs - Myc能够与AtHIRs - Flag发生强烈的免疫沉淀，证实AtHIR4能够通过自相互作用形成同源寡聚体，然而，在SsPEIE1存在的情况下，AtHIRs - Flag和AtHIRs - Myc之间的相互作用显著减弱(图5d )。这些结果表明SsPEIE1竞争性结合AtHIR4，削弱其自身相互作用。将AtHIR4第157位的缬氨酸突变为甘氨酸( AtHIR4v157a )显著降低了其寡聚体形成能力。在Co - IP实验中，与野生型AtHIR4相比，AtHIR4v157a的自结合能力减弱(图5e )。此外，SsPEIE1与AtHIR4v157a的相互作用减弱(图5f )。为了阐明AtHIR4寡聚化对植物抗病性的影响，在本氏烟叶片中表达GFP、SsPEIE1、AtHIR4v157a和AtHIR4，并在侵染36 h后接种核盘菌(图5h)。结果表明，SsPEIE1的表达使本氏烟对核盘菌更易感，与接种SsPEIE1转基因拟南芥的结果一致(图2a )。AtHIR4的表达显著提高了本氏烟对核盘菌的抗性，但At HIR4v157a丧失了增强植株抗性的能力(图5g )。AtHIR4v157a表达叶片上的病斑面积与GFP表达叶片上的病斑面积没有显著差异(图5i )，核盘菌的相对生物量也表现出较为一致的趋势(图5j )。这些结果表明，AtHIR4寡聚体的形成对于植物对核盘菌的抗性至关重要，而SsPEIE1通过与AtHIR4相互作用来抑制其同源寡聚体的形成，从而促进植物的感病性。图5 SsPEIE1竞争性结合AtHIR4并破坏其寡聚化能力和寡聚化介导的抗病性该研究首先鉴定了一个核盘菌分泌蛋白SsPEIE1，通过构建突变体、异源转化等方法从表型、生理、免疫相关基因表达水平等多个角度证明其作为效应子干扰宿主免疫，然后通过酵母双杂筛库筛选与SsPEIE1互作的蛋白，并通过Y2H、Co-IP等实验验证蛋白互作，之后进一步研究AtHIR的功能，最终揭示SsPEIE1发挥作用的分子机制——通过与关键免疫因子AtHIR4相互作用，抑制AtHIR4寡聚化介导的免疫反应，从而促进核盘菌侵染。病原菌效应子研究本质上还是两个基因或三个基因互作研究，只不过这些基因来源于两个不同的物种。该研究为病原菌效应子研究提供启发，并为核盘菌抗性提供了新的基因资源。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-53725-0
