PC | 揭示高温抑制葡萄花色苷合成的分子机制

研究背景

花青素是一种类黄酮化合物，具有抗氧化特性，可以保护光合作用机制免受过度太阳辐射造成的损害。 此外，还具有抗外界胁迫的能力，并抵御食草动物和病原体的侵害。对于果实来讲，花青素会影响葡萄（Vitis vinifera）等水果的品质。高温通过抑制花青素生物合成基因的表达和降低生物合成速率来降低花青素水平。然而，协调这两个过程的调控机制在很大程度上仍然未知。

研究结果

1.高温抑制的花青素积累取决于生长素途径

为了探究成熟阶段的高温抑制了葡萄浆果皮中花青素的积累现象，作者设计了有关温度的实验来研究温度对玫瑰香“Muscat Hamburg”浆果转色过程的影响（图 1A-D）。由于高温条件会改变生长素相关基因的表达，在此背景下，作者推测高温引起的浆果着色缺陷与生长素反应有关。为了验证这一假设，首先测定了生长素浓度和生长素相关基因在高温下的表达水平（图 1E-F）。接下来，作者使用天然生长素IAA、合成生长素（PIC）和生长素生物合成抑制剂yucasin研究了生长素对葡萄愈伤组织着色的影响。而后评估了生长素在高温条件下的作用（图1G和1H），结果显示与对照组相比，在40°C下外源施用IAA和PIC进一步抑制了花青素的积累。相比之下，yucasin处理的愈伤组织对高温不太敏感，表现出稳定的花青素积累和花青素生物合成结构基因的较高表达水平（图1H）。这些结果表明，高温引起的花青素积累缺陷取决于生长素途径。

图 1. 高温抑制的花青素积累取决于生长素途径

2. 高温条件下内质网应激影响花青素生物合成

为了探究内质网应激会不会损害花青素的生物合成，作者在转色前阶段用内质网应激诱导剂膜霉素 (TM) 和内质网应激缓解剂牛磺熊去氧胆酸 (TUDCA) 处理葡萄浆果。结果发现当内质网处理能力受损时，花青素生物合成会受到抑制。 相比之下，TUDCA 处理可减轻 ER 应激，增强浆果着色、花青素积累以及生物合成基因的表达（图2，A-D）。后又研究了高温引起的花青素生物合成破坏与ER应激之间的关系（图 2，E-H），表明高温对蛋白质折叠和分泌机制的干扰在很大程度上导致了花青素生物合成缺陷。

图 2. ER 应激影响高温条件下花青素的生物合成。

3. VvFHY3 是花青素生物合成的正调节因子

为了鉴定高温下花青素生物合成的调节因子，作者对所有花青素生物合成基因中的启动子顺式元件进行了生物信息学分析。结果发现，VvCHS1、VvF3H1、VvLODX、VvF3’H1、VvF3’H2和VvANS启动子中还可能存在FHY3/FAR1的结合位点。为了确定这些基因是否是VvFHY3的直接靶基因，作者进行了酵母单杂，电泳迁移率变化分析，染色质免疫沉淀检测以及本氏烟草叶片中的瞬时表达分析，这些结果表明VvFHY3可以直接结合花青素生物合成基因的启动子并促进其表达（图3，A-G）。

图 3.VvFHY3 直接调节花青素生物合成基因表达。

图 4. VvFHY3 在高温条件下调节葡萄花青素生物合成。

4. VvARF3 与 VvFHY3 发生物理相互作用

生长素对VvFHY2具有负调控作用。鉴于生长素响应因子（ARF）是生长素信号传导的重要调节因子，通过与靶基因的直接结合，作者研究了VvFHY3和VvARF之间潜在相互作用。首先通过酵母双杂交和萤火虫荧光素酶互补成像（LCI）分析发现植物中只有VvARF3与VvFHY3相互作用（图5 A-B）。接着，通过Pull-down和Co-IP实验分别进行了体外和体内的互作实验，进一步证实了VvFHY3与VvARF3之间确实存在物理相互作用（图5，C-D）。

图 5.VvFHY3 与 VvARF3 相互作用。

5. VvARF3抑制VvFHY3对花青素生物合成相关基因的转录活性

为了探究VvARF3 对 VvFHY3 花青素生物合成基因转录激活的影响，作者进行了瞬时表达测定，表明VvARF3抑制VvFHY3对VvCHS1表达的转录激活活性（图 6 A）。然后，作者通过在葡萄浆果和愈伤组织中过表达或沉默VvARF3来研究其功能影响。葡萄浆果中VvARF3的瞬时过表达抑制了浆果着色并降低了花青素水平，而沉默VvARV3则具有相反的效果（图6C-6F）。除此之外，VvARF3-OE稳定转化葡萄愈伤组织会损害花青素的生物合成，而与对照组相比，VvARF3-RNAi系表现出花青素含量的增加（图6G和6H）。这些发现都支持了VvARF3作为葡萄花青素生物合成负调节因子的作用的观点。

图 6.VvARF3 抑制 VvFHY3 对花青素生物合成基因表达的转录活性。

6. 高温诱导的内质网应激损害花青素生物合成，并依赖于VvFHY3介导的VvbZIP17抑制

由于VvFHY3-OE 愈伤组织对高温抑制的花青素积累的敏感性降低，因此作者检测了VvFHY3-OE 中花青素的过量产生是否也可能受到 TM 引起的 ER 功能障碍的影响。当接受TM处理时，我们发现与野生型对照相比，VvFHY3-OE愈伤组织中VvbZIP17和VvBIP3表达水平的诱导降低，支持了VvFHY3过表达系中UPR激活减弱的观点。酵母单杂交试验表明，VvFHY3直接与VvbZIP17启动子结合，表明了其特异性（图7A）。还分别进行了EMSA和ChIP检测，以进一步确认体外和体内的相互作用（图7B和7C）。为了探讨 VvFHY3 是否在转录上调节 VvbZIP17，作者在本塞姆氏烟草叶子中进行了瞬时表达测定。 结果显示，与空载体对照相比，当与VvFHY3共表达时，由VvbZIP17启动子驱动的LUC报告基因活性降低（图7D），表明VvFHY3抑制VvbZIP17转录。 总之，这些结果表明 VvFHY3 直接结合 VvbZIP17 启动子并抑制其表达。

图7.VvFHY3通过直接抑制VvbZIP17转录来调节花青素的合成。

7. VvFHY3与VvbZIP17相互作用，并与其竞争结合VvBIP3启动子

作者通过酵母实验发现VvFHY3与VvbZIP17发生物理相互作用（图8A和8B）。通过GST下拉实验进一步分析表明，GST-VvFHY3的N端（aa 1-251）可以直接与VvbZIP17的N端相互作用（aa 1-455），但不能与其C端相互作用。（图8C）。VvFHY3和VvbZIP17之间的相互作用通过本氏烟草叶片中的CO-IP分析得到了进一步证实（图8D）。这些结果支持VvFHY3和VvbZIP17相互作用的结论。鉴于VvFHY3和VvbZIP17之间的相互作用，以及它们在VvBIP3启动子上的共占用，作者研究了它们在UPR基因上的DNA结合活性是否相互影响。此外，作者还采用了EMSA以及体外DNA下拉试验，通过双抗体免疫沉淀和检测His-VvbZIP 17蛋白定量评估VvbZIP 17的DNA结合能力（图8 E-F）。接下来，通过在本氏烟草叶片中的瞬时表达分析研究了VvFHY3-VvbZIP17的DNA结合竞争对UPR基因激活的影响（图8G-H）。以上结果表明，VvFHY3通过干扰其DNA结合能力来抑制VvbZIP17对UPR基因表达的转录活性。

图 8. VvFHY3 与 VvbZIP17 相互作用，并与其竞争与 VvBIP3 启动子的结合

8. VvARF3干扰VvFHY3和VvbZIP17之间的相互作用

作者为验证高温激活UPR是否与生长素水平相关的假说，使用IAA和ER胁迫剂处理葡萄愈伤组织，以研究这些因子是如何影响UPR活化和花青素生物合成的。结果表明，添加TUDCA部分恢复了生长素介导的花色素苷含量和生物合成基因表达水平的抑制（图9，A至C），表明UPR途径参与了生长素介导的花色素苷积累的减少。为了揭示生长素在UPR激活中的作用机制，作者又研究了VvARF 3对UPR基因表达的影响。为了揭示生长素在UPR激活中的作用机制，作者探究了VvARF3对UPR基因表达的影响。在VvARF3 OE愈伤组织中观察到VvBIP3和VvbZIP17的表达增加，表明VvARV3正向调节UPR激活。同时，VvFHY3对VvbZIP17诱导的VvBIP3激活的抑制作用可以通过添加VvARF3显著恢复（图9E和9F），这表明VvARV3拮抗了VvFHY3对VvbZIP17的抑制作用。

图9.VvARF3干扰VvFHY3和VvbZIP17之间的相互作用

研究结论

本文作者鉴定了一种参与花青素生物合成的调节因子VvFHY3，并证明高温通过VvARF3介导的生长素途径调节其活性。此外，还发现VvFHY3通过物理相互作用和启动子结合抑制VvbZIP17活性，限制UPR激活并缓解ER应激。基于这些发现，作者提出了一种模型，其中VvFHY3整合了生长素和ER胁迫途径，以控制高温条件下花青素的生物合成。当葡萄浆果经历高温胁迫时，生长素途径受到刺激。一方面，由于VvFHY3的不稳定，花青素生物合成基因转录本减少，VvARF3的抑制降低了VvFHY3的转录活性。另一方面，VvFHY3活性的降低提高了其对VvbZIP17的抑制作用，引发了过度的UPR，从而进一步抑制了花青素的生物合成（图10）。