2024年9月中国科学院植物研究所植物分子生理学重点实验室The Plant Cell在线发表了题为“The rice R2R3 MYB transcription factor FOUR LIPS connects brassinosteroid signaling to lignin deposition and leaf angle”的研究论文。该研究中鉴定了非典型 R2R3-MYB 转录因子 FOUR LIPS (OsFLP),其表达的时空特异性与维管束和厚壁细胞中的木质素沉积密切相关。并且,OsFLP 在 BR 信号传导中与 OsGSK1 和 OsBZR1 一起发挥作用,通过调节木质素沉积来维持水稻的最佳叶角。
· 实验结果 ·
1. OsFLP突变导致叶角增大
点突变水稻突变体Osflp-1 的成年植物表现出松散的植物结构表型(图 1,A 和 B)。 引入由其原启动子驱动的 OsFLP 基因组区域组成的转基因改善了 Osflp-1 植物的突变表型(图 1、C 和 M)。通过比较植物顶部的第三片叶子,发现在Osflp-1植物中,顶部第三片叶子的叶角增加至21°±6(图1F),而互补系中的叶角减小至7°±4(图1,G和H)。细胞学观察发现,位于0ab和1ab维管束之间的背面,薄壁细胞的数量和长度相似(图1,Q,T和 S)。Osflp-1叶枕中位于4ab和5ab维管束之间(靠近边缘)的实质细胞显著长于ZH11,但细胞数量相似(图1,Q,T和U)。这些结果表明,OsFLP通过限制水稻近轴端薄壁细胞的伸长参与叶枕不对称生长从而发挥对水稻株型的调节作用。
Figure 1. The mutation of OsFLP leads to a loose plant architecture with increased leaf angles.
2. OsFLP 优先在发育中的叶枕中表达
作者在 15 日龄幼苗的第二片完整叶的叶片接头处优先观察到GUS 信号(图 2,A 和 B)。在S1阶段没有检测到 GUS 信号,这表明OsFLP可能不是叶枕形成所必须的(图 2,C 和 C')。 S2阶段在远轴侧(0ab)的中央维管束和大维管束中观察到GUS信号(图2,D和D')。而在S3和S4阶段,GUS信号出现在新形成的维管束中。这些结果表明,OsFLP 在叶片关节中的优先和动态表达与其在叶片关节发育和叶角形成过程中的功能特异性密切相关。
Figure 2. Spatial and temporal expression patterns of OsFLP in developing lamina joints
3. OsFLP 介导 BR 信号传导至椎板接头木质素沉积
为了研究 OsFLP 是否参与 BR 信号传导来调节叶角,作者进行了叶枕弯曲测定。与ZH11相比,Osflp-1对eBL高度敏感,表明OsFLP可能参与BR信号下游的叶角形成(图3,A和B)。间苯三酚-HCl染色的厚壁细胞总面积的定量分析表明,eBL处理可以显着减少ZH11叶枕远轴和近轴厚壁细胞中的木质素沉积。而Osflp-1木质素水平对 eBL 和 BRZ 处理没有显着变化(图 3,S 和 T)。因此,OsFLP可能参与调控BR信号介导的木质素生物合成和沉积。
Figure 3. OsFLP mediates BR signaling to lignin deposition in lamina joints.
4. OsFLP 是 OsBZR1 的直接靶基因
对OsFLP基因和启动子序列进行分析后,作者发现2个用于OsBZR1结合的推定BR响应元件(BRRE),然后基于酵母单杂,EMSA和ChIP-qPCR实验证明了OsFLP是OsBZR1的直接靶基因(图4,A-E)。
Figure 4. OsBZR1 regulates OsFLP transcription via a direct binding to the BRREs.
5. OsFLP 连接 OsBZR1 信号传导和木质素沉积
在之前研究中,作者对 Osflp-1 突变体进行了转录组测序,确定了突变体中 115 个差异表达基因 (DEGs)。进一步研究表明OsPAL4和OsPAL6的转录受到OSFLP介导的BR信号通路的调控。LUC试验证实了OsFLP能够激活下游基因OsPAL4和OsPAL6的转录(图6,A-C)。为了鉴定 OsPAL4 和 OsPAL6 启动子区域内推定的 OsFLP 结合位点,作者进行了 ChIP-qPCR 实验(图 6、D 和 E)。木质素生物合成相关基因均未在 eBL 处理后表现出明显的变化。这些结果表明,OsFLP 通过直接调节 OsPAL4 和 OsPAL6 转录,正向介导木质素生物合成的 BR 信号传导。
Figure 6. OsFLP activates transcription of OsPAL4 and OsPAL6.
6. OsFLP 在负反馈环路中调节 OsGSK1
作者在前期ChIP-seq数据发现OsGSK1转录水平在Osflp-1突变体中显着上调,而在OsFLP-OE转基因植物中下调。并通过酵母单杂,EMSA,CHIP-qPCR等试验证实了OsFLP能够特异识别并结合OsGSK1启动子区域结合元件(图 7. A-E)。表型分析表明,与ZH11相比,Osgsk1和Osgsk1 Osflp-1植物都具有松散的植物结构。定量分析表明,Osgsk1的顶部第三叶角度略大于ZH11,但比Osflp-1窄。 Osgsk1 Osflp-1 双突变体的叶角介于 Osgsk1 和 Osflp-1 之间(图 7,J 至 N)。 免疫印迹分析显示,在Osflp-1中OsBZR1的磷酸化水平更高,在Osgsk1中则相反。综上所述, OsFLP 整合 BR 信号以维持适当的叶角,将 OsBZR1 介导的 BR 信号传递至木质素生物合成,并通过 OsGSK1-OsBZR1 上的反馈环调节 BR 信号。
Figure 7. OsFLP feedback represses OsGSK1 transcription and subsequently affects OsBZR1 phosphorylation.
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评论:李昕琪
编辑:黄文尉
校对:付小康
林木科学评论
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