New Phyto|苹果树腐烂病菌效应子VmSpm1作用机制

科技 2024-11-10 22:56 北京

近日，西北农林科技大学黄丽丽团队在New Phytologist上发表了一篇题为“VmSpm1: a secretory protein from Valsa malithat targets apple’s abscisic acid receptor MdPYL4 to suppress jasmonic acid signaling and enhance infection”的研究论文。该论文鉴定了一个来自苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的效应子VmSpm1，并解析了其干扰寄主免疫的分子机制。

研究背景

苹果树腐烂病(Apple Valsa canker, AVC)是一种由苹果树腐烂病菌引起的严重病害，严重制约了苹果产业的发展。病原真菌如苹果树腐烂病菌通过分泌效应蛋白来操纵宿主防御和促进感染。枯草杆菌蛋白酶被鉴定为潜在的毒力因子，但它们在果树病原菌中的具体作用，还知之甚少。

研究结果

VmSpm1作为抑制Bax触发的细胞死亡的效应因子

前期的蛋白组分析发现VmSpm1在苹果树腐烂病菌侵染过程中显著上调表达。VmSpm1编码333个氨基酸(aa)的蛋白，分子量为57.14 kDa，具有1个信号肽(SP)和2个保守的结构域：Inhibitor _ I9和Peptidase _ S8 (图1a )。qPCR分析发现，VmSpm1在侵染过程中上调表达(图1b )。

为了评估VmSpm1预测的SP的功能，研究者使用酵母系统进行分泌能力的验证。在以蔗糖为唯一碳源的YPRAA培养基上，阴性对照pSUC2 - ev不能生长，而携带VmSpm1 SP的酵母菌株正常生长，与阳性对照pSUC2 - Avr1b SP相似(图1c )。此外，作者将pCAMBIA1302 - VmSpm1 - GFP和pCAMBIA1302 - VmSpm1^Δ^SP - GFP载体导入本氏烟，并通过Western blotting检测GFP融合蛋白在叶片质外体中的表达。结果表明，在总蛋白样品中同时存在VmSpm1 - GFP和VmSpm1^Δ^SP - GFP。然而，在质外体中只有VmSpm1 - GFP被成功检测到(图1d )。这些结果表明，VmSpm1的SP是一个功能性的分泌信号，证实了VmSpm1是一个分泌蛋白。

为了评估VmSpm1作为效应子在植物免疫反应中的功能，作者通过实验研究了VmSpm1对Bax和INF1诱导的PCD的影响。结果发现，VmSpm1与Bax共表达有效抑制了Bax诱导的本氏烟叶片PCD (图1e )。然而，VmSpm1不能抑制INF1诱导的细胞死亡(图1f )。为了确定VmSpm1抑制Bax诱导的细胞死亡的区域，研究者开展了进一步的实验。这些结果表明，VmSpm1可能作为细胞质效应因子发挥作用，并且VmSpm1的肽酶S8结构域在抑制Bax诱导的植物PCD中发挥作用。

图1 效应子VmSpm1的功能分析

VmSpm1对于V.mali的完全毒力是必需的

为了确定VmSpm1是否与病原菌的毒力和侵染过程中的生长有关，作者构建了VmSpm1基因敲除菌株ΔVmSpm1，并筛选获得其互补突变株ΔVmSpm1 – C。菌丝营养生长实验表明，VmSpm1基因对V.mali菌丝生长无显著影响(图2a )。利用野生型03 - 8菌株、ΔVmSpm1和ΔVmSpm1 - C菌株对离体叶片和小枝进行致病力测定，发现ΔVmSpm1的致病力降低，小枝平均病斑大小和叶片平均病斑大小分别比野生型菌株降低了46 %和73 % (图2b - f )。而接种Δ VmSpm1 - C恢复了WT的表型，强调了VmSpm1在V.mali感染中的关键作用。

图2 VmSpm1对V.mali致病力有贡献

在苹果中异源表达VmSpm1抑制了苹果对V.mali的防御反应

研究者在苹果叶片中瞬时表达VmSpm1，随后接种V.mali菌丝，发现这些叶片的病斑比对照组增加了16 % (图3a )。免疫印迹分析证实VmSpm1蛋白在转基因植株中成功积累(图3b )。此外，在过表达VmSpm1的植株中，防御相关基因MdPR4、MdWRKY33、MdWRKY40和MdCYP81F2的表达量显著低于对照(图3c )。此外，研究者测定了接种V.mali后苹果叶片中ROS爆发和胼胝质沉积的水平。结果表明，与对照相比，过表达VmSpm1的叶片中ROS爆发水平和胼胝质沉积水平均较低(图3d、e)。这些结果表明，VmSpm1能够抑制寄主的防御反应，从而降低苹果对V.mali的抗性。

图3 VmSpm1在苹果中的表达降低了苹果对AVC的抗性

VmSpm1与MdPYL4互作

通过免疫共沉淀质谱( IP-MS )分析，研究者在苹果中鉴定出8个候选靶蛋白作为VmSpm1的潜在互作蛋白。由于ABA信号通路在调节植物与病原菌互作中的关键作用，研究者选择ABA受体MdPYL4作进一步研究。VmSpm1 - mCherry与MdPYL4 - GFP融合蛋白共浸润本氏烟叶片，在质膜和细胞质上均有共定位，表明它们之间存在潜在的联系。

通过酵母双杂交( Y2H )实验进一步证实，与MdPYL4和VmSpm1共转化的酵母细胞在-Trp / -Leu / -His / -Ade + X -α- gal培养基上生长旺盛，呈蓝色(图4a )。Y2H实验证实了VmSpm1的两个结构域VmSpm1^S8和VmSpm1^I9与MdPYL4之间的相互作用，并且两个结构域都表现出相互作用。此外，用共表达MdPYL4 - GFP和VmSpm1 - mCherry的本氏烟叶片进行的Co - IP实验证实了它们之间的相互作用(图4b )。除此之外，在VmSpm1和MdPYL4共侵染的本氏烟叶片中检测到强烈的荧光素酶信号，表明它们之间存在相互作用(图4c )。双分子荧光互补实验也支持VmSpm1与MdPYL4在质膜和细胞质上的互作(图4d )。这些结果从体外和体内共同证明了VmSpm1和MdPYL4之间的相互作用。

图4 VmSpm1与MdPYL4互作

MdPYL4正调控苹果对苹果树腐烂病菌的抗性

为了研究MdPYL4在苹果响应苹果树腐烂病菌侵染中的作用，在苹果叶片中瞬时过表达MdPYL4。V.mali侵染后，过表达MdPYL4的叶片比对照叶片的病斑面积小50 %。

为了进一步研究MdPYL4在苹果防御V.mali中的功能，研究者构建了MdPYL4过表达载体，并将其转化到野生型'Orin'苹果愈伤组织中，获得了稳定表达MdPYL4的转基因株系MdPYL4-OE，其MdPYL4的表达量相对于野生型提高了13倍(图5a )。接种后，观察到MdPYL4 - OE愈伤组织的真菌菌斑面积比WT对照小70 %(图5b )。

此外，研究者构建了MdPYL4-RNAi转基因株系，与野生型相比，MdPYL4的表达量降低了90 % (图5c )。V.mali侵染后，MdPYL4 - RNAi植株的病斑面积比WT植株增加了31 % (图5d )。此外，与野生型植株相比，Md PYL4 - RNAi植株中防御相关基因的转录水平显著降低(图5e )。ROS爆发和胼胝质沉积也有所减少(图5f , g)。这些结果证明了MdPYL4在增强苹果对V.mali的抗性中起着正调控作用。

图5 MdPYL4正调控苹果对AVC的抗性

VmSpm1以酶依赖的方式降解MdPYL4

在体外，MdPYL4 - GST与VmSpm1 - His共孵育，导致MdPYL4水平呈时间依赖性降低(图6a )。而使用His蛋白的对照中没有观察到降解，表明VmSpm1在体外特异性降解MdPYL4。研究者利用MdPYL4 - GST检测VmSpm1^I9 - His和VmSpm1^S8- His，结果表明，只有VmSpm1^S8 - His能够降解MdPYL4 (图6a )，突出了S8结构域在这一过程中的关键作用。

为了验证VmSpm1的体内降解能力，研究者将VmSpm1 - mCherry与MdPYL4 - GFP、MdPYL8GFP或MdBAK1 - GFP在本氏烟叶片中共表达。结果发现，与单独使用mCherry的对照相比，VmSpm1 - mCherry处理后MdPYL4 - GFP和MdPYL8 - GFP的水平显著降低，而MdBAK1 - GFP的水平保持不变。这证实了VmSpm1降解底物的特异性(图6b )。此外，亚细胞组分显示，VmSpm1在细胞质和质膜组分中都能降解MdPYL4 (图6c )。

为了评估VmSpm1的酶活性在MdPYL4降解中的作用，作者对VmSpm1中的催化残基Asp - 193、His - 225、Asn - 326和Ser - 391进行定点突变，分别用丙氨酸替换(图6d )。当突变蛋白与MdPYL4 - GST共孵育时，与野生型VmSpm1和单独的MdPYL4对照相比，突变蛋白表现出降解能力的丧失(图6e )。此外，VmSpm1^S391A - mCherry与MdPYL4 - GFP在本氏烟叶片中的共表达没有导致MdPYL4 - GFP水平的降低，而与WT VmSpm1 - mCherry观察到的降低不同(图6f )。这些发现表明VmSpm1对MdPYL4的降解依赖于其蛋白酶活性。

为了进一步研究VmSpm1是否在侵染过程中降解MdPYL4，研究者比较了MdPYL4-RNAi植株和WT植株接种03 - 8和ΔVmSpm1后的抗病性。结果显示，与03 - 8相比，感染ΔVmSpm1的WT植株上的病斑减少了26 %，而MdPYL4- RNAi植株上的病斑仅减少了11 % (图6g )。这表明MdPYL4是VmSpm1的特异性靶标。

图6 VmSpm1在体内和体外介导MdPYL4的蛋白降解

VmSpm1抑制MdPYL4介导的JA信号通路

研究者首先分析了JA合成和信号传导基因( MdAOC、MdAOS和MdMYC2)的表达，发现它们的表达在MdPYL4 - RNAi植株中减弱(图7a )。在苹果叶片中过表达VmSpm1进一步抑制了JA相关基因的表达(图7b )。MdPYL4 - RNAi植株中的JA水平低于WT植株，当感染ΔVmSpm1时，MdPYL4 - RNAi和WT植株中的JA水平均高于03 - 8菌株(图7c )。这些结果表明，在苹果树腐烂病菌侵染过程中，VmSpm1抑制苹果JA合成，而MdPYL4促进JA合成。

ABA处理后，MdPYL4 - RNAi植株的气孔关闭受损，表明MdPYL4对苹果ABA感知至关重要(图7d )。此外，VmSpm1过表达导致气孔关闭受损，与MdPYL4降解实验结果一致(图6 )。为了进一步探究MdPYL4对JA水平的提高是否依赖于ABA的感知，作者对WT植株和MdPYL4 - RNAi植株施加外源ABA。结果显示，ABA处理上调了JA信号和合成基因的表达，显著提高了野生型植株中JA的含量(图7e )。在MdPYL4-RNAi植株中，JA水平随着ABA的施加而增加，但仍然低于WT植株，即使没有ABA (图7f )。最后，为了确定JA生物合成减少是否影响抗性，研究者将外源MeJA施加到MdPYL4 - RNAi植株中，发现其恢复了对V.mali的抗性，表明抗性降低是由于JA合成减少所致(图7g )。综上所述，VmSpm1通过降解MdPYL4来调节JA信号通路从而调控植物免疫。

图7 VmSpm1通过MdPYL4调控植物JA的生物合成和信号传导

评述

该研究首先鉴定了来自苹果树腐烂病菌(V.mali)的效应子VmSpm1，发现其能够抑制寄主的防御反应，通过IP-MS分析，研究者鉴定到了与VmSpm1互作的对V.mali抗性具有正调控作用的ABA受体MdPYL4。通过进一步的研究发现，VmSpm1以酶依赖的方式降解MdPYL4，最终总结提出VmSpm1干扰寄主免疫的分子机制——通过降解MdPYL4来调节JA信号通路从而干扰植物免疫（图8）。效应子在病原体致病过程中发挥重要作用，病原体通常需要部署足够多的功能冗余的效应子来感染宿主。本文为我们提供了一个系统性研究效应子功能的范例，同时为苹果树腐烂病防治提供了理论依据。

图8 VmSpm1干扰寄主免疫的分子机制

评述丨曹德龙

编辑丨史文成

原文链接：10.1111/nph.20194

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