浙江大学生命科学学院植物生理生化国家重点实验室2021年在Molecular Plant杂志上发表了题为“A transcription factor STOP1-centered pathway coordinates ammonium and phosphate acquisition in Arabidopsis”的研究论文。该研究发现铵是一种新型引发剂，可刺激缺磷条件下拟南芥根细胞细胞核中关键调节蛋白 STOP1的积累，来协调铵盐和磷酸盐的吸收。
研究背景
磷（P）是植物生长发育不可缺少的常量营养素。天然磷酸(Pi)储量是有限的，因此更好地了解作物对Pi的利用对于全球粮食安全至关重要。众所周知，铵可以提高农业中Pi的获取效率；然而，协调Pi营养和铵的分子机制仍不清楚。
研究结果
铵影响磷缺乏引起的主根抑制
低Pi会抑制在含有2.5mM NH4NO3的改良MS培养基中生长的野生型植株的主根伸长（图1A和1B），但并不影响在KNO3培养基上植株的表型。研究人员用铵转运蛋白四重敲除突变体qko(amt1;1amt1;2amt1;3amt2;1)来检验铵的转运是否是缺磷响应必需的。在低Pi条件下，高浓度的NH4+对根系生长的抑制作用明显强于低浓度（图1C和1D），表明铵转运体介导的铵吸收参与了低Pi诱导的主根生长抑制。
图1.缺磷诱导的主根抑制依赖于NH4+及其转运
铵能刺激STOP1蛋白的积累
研究人员测试了铵对野生型和stop1功能缺失突变体根长的影响。在有铵存在的低Pi条件下，stop1突变体的主根生长仍然不受影响（图2A和2B）。
STOP1的转录在缺Pi条件下对铵不敏感（图2C）。但通过自身启动子（pSTOP1::GFP-STOP1）下表达荧光标记的STOP1蛋白，可以观察到STOP1蛋白对铵盐的敏感性。发现在低Pi条件下，如果没有铵，就检测不到GFP-STOP1蛋白。相反，当铵盐存在时，STOP1蛋白的荧光点清晰可见（图2D）。处理3小时后仍能观察到STOP1的积累，0.1mM NH4+足以刺激STOP1的积累（图2E和2F）。然而，当介质pH值用MES缓冲时，铵诱导的STOP1积累在缺Pi处理3小时后大大减少（图2E和2F）。
图2.Pi缺乏条件下NH4+诱导的根生长抑制取决于STOP1蛋白
磷缺乏条件下铵吸收引发根际酸化
鉴于低Pi激活的STOP1积累是pH依赖性的，为了确定Pi缺乏是否会促进铵的吸收，从而导致根际的酸化，研究人员首先检测了在含有pH指示剂的低Pi培养基中生长的根系的酸化能力，结果发现在缺铵的情况下根系没有明显的酸化（图3A）。然而，在含有0.1-2.5mM NH4+的Pi缺乏培养基上生长的野生型根际酸化被检测到。进一步发现，Pi缺乏显著增加了野生型植株对15NH4+的吸收（图3B）。同样，qRT-PCR分析表明，低Pi处理会上调AMT1;1和AMT1;2的表达（图3C）。
图3.低Pi会增强根外对NH4+吸收和酸化
铵-STOP1模块刺激不溶性Pi的利用
有研究表明，柠檬酸盐或苹果酸盐的两个转运体在STOP1的控制下会因Pi缺乏而上调。为测试铵激活的核STOP1的积累是否有助于磷的获得，用难溶的磷酸铁(Fe-Pi)和磷酸钙(Ca-Pi)处理幼苗。发现野生型和stop1突变体植株在提供铵的情况下都比在无铵培养基中生长的植株生长得更好。此外，野生型与stop1突变体在供应Ca-Pi时的生长差异小于供应Fe-Pi时的生长差异（图4A和4B）。同样，与硝酸盐培养基相比，在铵存在的两种不溶性Pi条件下，Pi的获得都显著增强（图4C）。特别是当向植株提供Fe-Pi时，野生型幼苗的Pi含量明显高于stop1突变体（图4C）。为了确定植物从Fe-Pi和Ca-Pi中溶解Pi的能力是否与STOP1的功能密切相关，还检测了在含或不含铵的Fe-Pi和Ca-Pi培养基中生长的植物的STOP1积累情况。发现在没有铵的情况下，Fe-Pi和Ca-Pi培养基中没有观察到STOP1的积累；但在铵处理后，GFP信号被迅速观察到（图4D）。qRT-PCR结果进一步表明，在缺磷条件下，铵能迅速诱导ALMT1和MATE转运体的表达，而缺铵则在很大程度上阻止了这两个基因的诱导（图4E）。
图4.铵与STOP1信号一起促进不溶性磷酸盐的利用
STOP1的表达可减少铵的吸收
研究人员进一步测试了STOP1是否介导了铵吸收的反馈调节。发现当用硝酸盐处理植物时，AMT1s的转录水平在野生型和stop1突变体之间没有显著差异（图5A）。当在NH4NO3或有毒铵水平下，与野生型或在自身启动子（pSTOP1::GFP-STOP1）下表达荧光标记STOP1的互补系相比，stop1突变体中AMT1;1、AMT1;3和AMT1;5的表达水平明显增加（图5B）。此外，还检测了STOP1在高铵水平下是否会影响铵的吸收。与野生型和pSTOP1::GFP-STOP1互补幼苗相比，STOP1的缺失显著提高了铵的吸收能力（图5C）。
在以NO3-为唯一氮源的培养基中，野生型、stop1KO和stop1-3植物的生长没有区别（图5D）。然而，与野生型植株相比，stop1KO和stop1-3突变体在添加了5mM NH4+的培养基上生长时，其芽和根的生长受到阻碍（图5D）。将野生型和stop1突变体植株在MES缓冲培养基上生长，发现MES缓解了野生型和stop1植物的毒性症状（图5D-5F）。然而，与野生型幼苗相比，stop1KO和stop1-3突变体的根系仍然较短，鲜重降低（图5D）。
图5.当外部NH4 +浓度较高时，STOP1抑制NH4 +的吸收
STOP1通过激活CIPK23的表达来抑制铵的吸收
层次聚类分析表明CIPK23是STOP1的潜在靶标，为了确定CIPK23表达是否依赖于STOP1，研究人员将野生型和pSTOP1::GFP-STOP1转基因幼苗相比，发现stop1KO突变体植物中CIPK23的转录水平大部分被消除（图6A）。
根据DAP-seq数据，预测STOP1会与ATG483至453bp之间的CIPK23启动子区域结合（图6B）。通过拟南芥原生质体瞬时荧光素酶检测，发现与空载体对照相比，表达STOP1的原生质体中pCIPK23-LUC表达明显增强（图6C）。此外，电泳迁移实验证实了STOP1与CIPK23启动子的结合（图6D），并且通过添加未标记的竞争剂降低了这种结合活性。此外，CIPK23的T-DNA插入突变体（cipk23）在有Pi存在的有毒NH4+浓度下长出的根较短，与stop1突变体相似（图6E）。在NH4+胁迫条件下，stop1KOcipk23双突变体表现出更严重的表型，积累的NH4+浓度更高（图6E和6F）。
图6. STOP1通过激活CIPK23的表达来调节NH4+的吸收
评述
该研究揭示了一个新的信号通路：当植物对低Pi作出反应时，通过以STOP1为中心的转录网络，将铵营养与增加Pi的获取联系起来。并证明铵是Pi缺乏引起的STOP1积累的新型引发剂，可改善Pi从土壤中的获取。这些发现为制定可行的策略提供了一个框架，通过提高土壤中非生物可利用养分的利用率来提高作物产量。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2021.06.024
评述：张惠
编辑：赵一梅
