2024年11月南京大学孙博教授团队在《The Plant Cell》杂志发表了名为“KNUCKLES regulates floral meristem termination by controlling auxin distribution and cytokinin activity”的研究论文，揭示了KNUCKLES如何整合激素信号，确保花分生组织按时终止，为理解花发育调控机制提供了新视角。
研究背景：
KNUCKLES (KNU) 是一个关键的转录因子，它通过抑制 WUS 和 CLV3 基因来终止花分生组织（FM）。KNU还调控生长素和细胞分裂素的分布与活性，这对于花发育至关重要。具体来说，KNU直接抑制PIN1和IPT7基因的表达，并通过H3K27me3修饰来调节激素活性。KNU基因突变会改变这些激素在花芽中的分布。但是KUN如何整合这些激素信号来调控分生组织按时终止仍然处于未知状态。
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研究结果
一、KNU 协调生长素和细胞分裂素活性以调节 FM 决定性
研究表明，生长素和细胞分裂素在花分生组织（FM）的决定性中起作用。生长素促进干细胞分化，而细胞分裂素则维持干细胞活性。在花发育的第6阶段，生长素在心皮原基的顶部达到最大值，而细胞分裂素主要积累在心皮原基的中基部。通过双转基因植物实验，发现KNU的表达区域与生长素和细胞分裂素的分布部分重叠，表明KNU可能参与调节这些激素的活动。对野生型和knu-2突变体植物进行生长素和细胞分裂素相关药物处理后，观察到KNU可能通过调节生长素运输或细胞分裂素活性来控制FM的决定性。特别是，生长素运输抑制剂NPA部分挽救了knu-2的不定形表型，而细胞分裂素合成抑制剂lovastatin则完全消除了knu-2的不定形心皮表型。
图1
二、KNU 调节FM中的生长素分布和细胞分裂素活性
在花发育的第6阶段，KNU的表达与生长素分布密切相关。在野生型（WT）植物中，生长素在心皮原基的顶部中心区域达到最大值，而在knu-2突变体中，这一生长素最大值无法检测到。到了第10阶段，knu-2突变体在心皮原基的基底中心区域出现了生长素最大值，与WT植物不同，这与心皮和雄蕊原基的异位形成有关。在knu-2突变体中，心皮原基内的细胞分裂素信号比WT更强且覆盖区域更广。此外，到了花发育的第8阶段，WT心皮基底中心区域的细胞分裂素信号已无法检测，而knu-2中仍然可以观察到明显的细胞分裂素信号。通过检测细胞分裂素响应基因（A型和B型ARR基因）的表达水平，发现在knu-2中这些基因的表达显著上调。综上所述，KNU从花发育的第6阶段开始调节生长素的动态分布和细胞分裂素活性。
图2
三、KNU 对 FM 确定性的控制部分取决于生长素和细胞分裂素
细菌中的吲哚-3-乙酰胺水解酶（iaaH）能将生长素前体吲哚-3-乙酰胺（IAM）转化为活性形式的吲哚乙酸（IAA）。在植物中，IAM含量很低或几乎不存在。通过生成携带iaaH-eGFP的转基因植物，并与knu-2杂交，研究了提高KNU表达域内生长素水平的潜在效应。实验显示，iaaH-eGFP的表达模式与KNU相同，且在IAM处理后，knu-2/pKNU:iaaH-eGFP/DR5rev:3×VENUS-N7植物中检测到明显的生长素信号，表明局部生长素水平的降低可能是knu-2不定形心皮表型的部分原因。生成了knu-2/pKNU:CKX3-eGFP转基因植物，其中CKX3促进细胞分裂素的降解，发现knu-2的不定形心皮表型得到了大部分挽救。此外，通过生成knu-2 ahk2/+ ahk3 ahk4四突，其中AHKs基因突变导致细胞分裂素信号减弱，四突表现出比knu-2更弱的不定形心皮表型。相反，通过生成pKNU:IPT8-eGFP增加了WT背景下的局部细胞分裂素水平，一些pKNU:IPT8-eGFP心皮出现了类似knu-2的异位心皮，表明KNU也能调节细胞分裂素水平以控制FM的决定性。
图3
四、KNU 负向调节 PIN1 以部分控制 FM 确定性
研究发现KNU可以直接抑制PIN1基因的表达，并通过ChIP实验显示KNU在PIN1基因座上有显著富集，EMSA实验证实了KNU与PIN1基因的直接结合。在knu-2突变体中，PIN1基因座的H3K27me3修饰水平降低，表明KNU可能通过影响这一表观遗传修饰来调控PIN1。knu-2突变体中PIN1-GFP的表达模式更广泛，可能导致生长素分布的改变，从而影响心皮原基的生长素积累。双转基因植物实验显示KNU与PIN1在心皮原基的中部区域部分重叠，支持KNU直接抑制PIN1的表达。knu-2/pin1-1双突的表型较knu-2有所减弱，表明KNU通过调控PIN1来确保适当的生长素分布和花分生组织的及时终止。
图4
五、KNU 负向调节 IPT7 以部分控制 FM 确定性
在拟南芥花发育的第6阶段，KNU可能通过调控细胞分裂素代谢来发挥作用。研究发现，在knu-2背景下，IPT7基因表达上调约1.68倍，而其他细胞分裂素相关基因表达无显著变化。通过ChIP实验，发现KNU在IPT7基因座的P2区域显著富集，EMSA实验证实KNU可以直接结合IPT7基因的特定片段。共转染实验表明KNU能显著抑制IPT7启动子活性。在knu-2突变体中，IPT7 mRNA水平明显高于野生型，表明KNU直接抑制IPT7表达。ChIP实验还显示knu-2中IPT7基因座上的H3K27me3修饰水平降低。knu-2/ipt7双突变体表现出比knu-2更弱的不定形心皮表型，暗示knu-2中的异位心皮部分是由于IPT7表达升高导致的细胞分裂素分布失调。将IPT3和IPT5基因的突变引入knu-2/ipt7，得到的四突表现出更明显的表型恢复，表明多个IPT基因参与花分生组织（FM）的调控。综上所述，KNU通过直接抑制IPT7来确保适当的细胞分裂素水平，从而控制FM的决定性。
图5
六、PIN1 和 IPT7 的异位表达模拟 knu 突变表型
pKNU:PIN1和pKNU:IPT7转基因植物均展现出类似knu-2的不定形心皮表型，表明KNU启动子驱动的PIN1和IPT7异位表达足以诱导这种表型。通过NPA处理knu-2/DR5:GFP-ER植物，发现NPA处理组在心皮原基中检测到生长素信号，而对照组则未检测到，说明KNU通过直接调控PIN1表达来调节生长素分布，进而控制FM的决定性。将wus-7弱突变体与knu-2、pKNU:PIN1和pKNU:IPT7杂交后，所有杂交后代的不定形心皮表型消失，且与wus-7突变体相似，表明这些表型依赖于WUS活性的持续。在knu-2、pKNU:PIN1和pKNU:IPT7的第6阶段花朵中观察到WUS活性的延长，而在WT、NPA处理的knu-2和knu-2/ipt7双突中未检测到WUS-GFP信号，说明knu-2、pKNU:PIN1和pKNU:IPT7中的不定形心皮表型均依赖于WUS活性的持续。
图6
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研究总结与评述
图7
在这篇文章中，作者利用分子和遗传学的方法证明了KUN在花发育过程中的核心作用，通过直接调控PIN1和IPT7来影响生长素和细胞分裂素的分布，进而控制FM的决定性。WUS活性的持续是knu-2及相关转基因植物不定形心皮表型的关键因素。为我们认识和了解花发育过程的复杂分子调控机制提供了新的参考。
原文链接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae312
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林木科学评论
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评 论/编辑：韩少鹏
校对：廖晓利
