Science | 植物DCP5相分离组装形成渗透胁迫颗粒，揭示植物感受渗透变化调控生长的新机制

研究背景

研究内容

DCP5是脊椎动物RAP 55的拟南芥同源蛋白，在整个幼苗及分生组织中富集。在正常情况下，DCP5通常在胞质中扩散，在分生组织细胞中形成微小的灶点，而暴露于150mM NaCl溶液中时，DCP5会在短时间内组装成大的冷凝物。进一步将gDCP5-GFP/dct5-1转基因株系置于一系列非等渗溶液中，发现高渗透压下能够诱导DCP5形成大的凝聚体，且这种组装是高度动态的，与渗透应力呈正相关。大多数冷凝物能够自发分散，仅在细胞可渗透的PEG8000中分散明显延迟。在经历高渗-等渗循环的细胞中，DCP5在凝聚和分散状态间反复切换。此外，当细胞适应300mM甘露醇后，DCP5对等渗无反应，而对更高浓度的高渗后会发生明显的浓缩，表明DCP5对高渗而非盐浓度反应进行浓缩。作者团队也探究了DCP5的缩合是否具有潜在的触发因素，通过对自身蛋白水平、脱落酸积累及活性氧爆发等因素的研究实验，发现DCP5的浓缩与一些高渗典型信号无关。

图1：DCP5在高渗透胁迫下组装成细胞质凝聚体。

DCP5可逆的凝聚暗示了其可能受到如细胞体积变化的可逆性调节。随后作者结合三维实时成像与微流控芯片系统结合，开发了一种无干扰的细胞体积测量方法。经过计算，作者发现RME细胞在高渗透压下的体积变化同DCP5的凝聚高度同步。而当先使用1 M己二醇处理使细胞内渗透压更高时，能够抵消NaCl诱导的细胞压缩，进而防止了DCP5的凝聚，表明了细胞体积变化与DCP5缩合之间的相关性。类似地，作者在对高渗更为敏感的动物细胞中也进行了相关验证，最终表明DCP5的凝聚是由渗透细胞体积的变化所导致。

图2：DCP5凝聚体受渗透细胞体积变化的调节

DCP5的动态行为非常类似于蛋白质相分离。作者首先对DCP5的蛋白序列进行了无序区的预测，发现其在很大程度上是无序的。接着作者观察到了DCP5凝聚体的液体性质，表明它们是通过液-液相分离形成的。此外，在疏水作用力破坏剂1，6-己二醇处理下，根尖分生组织细胞中DCP5的凝聚体信号快速分散，表明其相分离是由疏水作用力驱动的。为了探究细胞体积是如何调节DCP5的相分离，作者使用基于荧光共振能量转移（FRET）的拥挤传感器（CRONOS），在高渗处理下的细胞中观察到增强的分子拥挤。重组蛋白DCP5在各种人工拥挤条件下也能够形成液滴，且大小与拥挤程度以及DCP5蛋白的量成正比。以上体外实验不仅证实了DCP5在分子拥挤时发生相分离，且模拟了DCP5对高渗透诱导的细胞收缩的细胞内行为，表明DCP5凝聚的物理性质。

图3：DCP5发生相分离以响应分子拥挤

作者进一步通过对DCP5蛋白进行截短来探究负责DCP5相分离的元件，发现LSm和FDF之间的IDR区域的缺失完全组织了DCP5的缩合。进一步作者将这一段IDR区域分成五部分，依次删除。发现随着IDR的缩短，DCP5的凝聚逐渐减弱，删除前三部分能够完全组织DCP5的缩合。因此，前三部分的IDR(IDR123)负责了高渗时DCP5的相分离。接下来，作者为了探究IDR 123如何感知分子拥挤，将IDR 123更替到CRONOS的感知元件上，通过FRET证实了在高渗处理期间FRET比率强烈增加，证实了两个荧光基团之间的距离缩短或IDR 123在高渗时被压缩。因此，IDR 123可以作为分子间拥挤传感器（ICS）来向DCP5进行传感。

随后，作者为了探究DCP5 ICS如何驱动相分离，鉴于DCP5的缩合是由疏水相互作用驱动，因此作者将ICS中23个亮氨酸进行了逐步突变，发现DCP5的缩合以联氨酸剂量依赖性的方式进行消退，相反，当讲10个天冬酰胺突变为亮氨酸时，缩合会更加明显。综上可知，ICS中的疏水残基，特别是亮氨酸在DCP5 ICS的分子拥挤传感和相分离中发挥重要作用。

图4：DCP5通过分子内拥挤传感器感知高渗透压

接下来，作者通过基于交联和差速离心的免疫沉淀技术，捕获并纯化了这些冷凝物。通过质谱揭示了DCP 5浓缩物的大量蛋白质募集。共鉴定出248种蛋白质作为DCP 5缩合物的潜在组分，包括RNA结合蛋白、翻译起始因子等。通过GO富集分析，作者发现它与NaAsO2诱导的人类SG以及热诱导的拟南芥SG的蛋白组有高度相似性。作为SG的特征，Poly A尾mRNA也受到了DCP 5缩合物的螯合。同时，DCP5也表现出与哺乳动物SG类似地同植物G3BP1的连续缩合，表明这两种蛋白形成了不同的缩合物。综上研究表明，DCP5能够作为一种受到高压诱导的独特类型的植物SG，并被作者指定为DCP 5富集的渗透胁迫颗粒（DOSGs）。

由于DCP5不具有任何典型的RNA结合结构域，为了探究DOSG是如何螯合mRNA，作者怀疑其是通过典型SG组分的RNA结合蛋白—多聚腺苷酸结合蛋白（PABs）所介导。随后，作者通过共免疫沉淀，PABs在DCP5凝聚体中的共定位，高渗条件下PABs会受到DCP5液滴募集以及DCP5 缺失使PABs的高渗缩合能力减弱，PABs缺失导致DCP5螯合mRNA作用的严重削弱等一系列实验证明了DCP5相分离以及同PAB的相互作用是DOSG螯合mRNA所必需的。

图5：DCP5冷凝物代表了一种独特类型的植物SG

作者进一步探讨DOSG的生物学功能，如在酵母中高渗休克降低了整体的翻译活性。通过多核糖体分析及转录组测序，作者确定了高渗透压诱导的野生型及dcp5-1突变体的翻译效率变化间的实质性差异。在高渗应激15min后，共有2118及1324个DCP 5依赖基因在翻译水平上表达下调及下调。其中，翻译、转录、细胞增殖等生长促进剂因受到抑制；而促进高渗适应的特定过程中的基因被激活。当DCP5通过MS 2BS-CP系统与GFP报告mRNA连接时，它作为翻译阻遏物直接抑制GFP mRNA的翻译。综上，DOSG的高浓度缩合及PABs的介导作用使得DCP5能够接近mRNA进行翻译
调控。这种快速的翻译重编可能代表了一个未知的植物渗透胁迫适应机制。

图6：DCP5在高渗胁迫下适应性地重编翻译组

通过凝聚体的隔离，DOSG阻止几种转录因子和核质转运蛋白入核，并影响细胞增殖转录。作者比较了高渗胁迫一小时后野生型与dcp5-a突变体株系间的转录组变化，发现共有346个转录本下调、304个转录被上调，且这些变化呈现出DCP5依赖性。GO富集分析显示下调基因中多参与生长发育过程，而上调基因则多为对胁迫和刺激的响应，表明DCP5在高渗透压下也可以将转录组从生长促进型重塑为胁迫适应型。

与其分子功能一致，作者发现将dcp5-1突变体植株转移至高渗培养基时，跟生长严重停滞。此外，突变体也表现出对干燥的敏感性增加。以上缺陷均可通过遗传回补DCP5成功挽救，但ICS缺失的DCP5则只能部分回复。以上实验表明，植物中需要由ICS介导的DOSG组装以适应高渗胁迫。

图7：DCP5是植物适应高渗胁迫所必需的

 讨 论 

在此次研究中，作者确定了DCP5作为一个多功能的渗透压传感器，参与渗透压传感与渗透胁迫适应。在等渗条件下，植物细胞体积稳定，DCP5主要分散在细胞质中；而在高渗胁迫使细胞体积收缩时，ICS感知到增强的分子拥挤，触发DCP5相分离及DOSG的组装。通过螯合mRNA及调节蛋白，适应性地重塑翻译组及转录组以帮助植物适应胁迫，调节生长。

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