MP | 基于挥发物GWAS解析OsWRKY19和OsNAC021是调控水稻香气的关键调节因子

植物在代谢过程中会产生大量具有高蒸汽压的低分子量亲脂性挥发物，这些挥发性代谢物通过与人类嗅觉受体的相互作用，作为芳香和风味分子发挥作用。这些挥发性化合物不仅在食品和农业工业中具有重要商业价值，还广泛用于调味、香料和药物的生产。对于水稻，香气是影响其烹饪质量和商业价值的关键因素。2-乙酰基-1-吡咯啉（2-AP）是稻米香味的主要成分，其独特的爆米花香气被认为是水稻香味的关键来源。然而，尽管2-AP已被广泛研究，水稻香气的代谢机制仍有许多未知之处。最近的研究表明，水稻香气不仅受OsBADH2基因的调控，还可能受到其他转录因子如OsWRKY19和OsNAC021的影响，这些因子对香气成分如FAVs的积累也有重要作用。

研究人员从水稻核心种质库中选择了204个水稻样本进行研究，探讨其挥发性代谢物含量变异的基因组基础（图1A）。首先，研究人员采用基于固相微萃取-气相色谱-质谱（SPME-GC-MS）技术的挥发物质总量（WTV）检测方法，成功检测到来自11个类别的133种重要挥发性代谢物，包括酸类、醇类、醛类、烯烃类、酯类、呋喃类、酮类、单萜类、倍半萜类以及苯类衍生物等（图1B）。分析结果显示，籼稻品种的大多数挥发性代谢物水平高于粳稻品种，且2-乙酰基-1-吡咯啉（2-AP）及脂肪酸衍生的挥发物（FAVs）在芳香水稻品种中的含量较高（图1C）。

随后，研究人员对水稻品种进行了香气感受评估，结果显示：爆米花香气的强度显著高于其他香气属性（图1D）。此外，2-AP和FAVs与香气评分的相关性明显高于其他挥发性代谢物（图1E）。香气感知通常归因于数百种嗅觉受体的激活，如hOR5A1受体与花香的愉悦感知相关，hOR2J3受体与清新的草香感知相关。因此，研究人员将2-AP和FAVs分别对接到hOR5A1（图1F–1I）和hOR2J3（图1J–1M）的底物结合中。对接分析表明，这些香气代谢物与hOR5A1和hOR2J3的底物结合中的氨基酸残基形成了多个氢键。以上结果表明，2-AP和FAVs是水稻香气的关键贡献者，是水稻香气的核心代谢物。

关键香气代谢物在不同水稻样本间表现出显著变异，且该多样化群体中快速的连锁不平衡（LD）衰减使得关联信号能够精确定位到相对较窄的基因组区域。研究人员使用混合线性模型筛选了4,860,573个高质量的单核苷酸多态性（SNP），从中鉴定出33个与水稻稻谷中挥发性代谢物含量显著相关的候选基因。

研究首先聚焦于2-AP，并成功鉴定出多个显著的基因组位点。其中，最显著的基因位点是SNP vg0820382857（P =1.88E-20），位于LOC_Os08g32870（OsBADH2）的7号外显子上（图2A）。该SNP（A-T，对应于位置731 bp）导致赖氨酸取代亮氨酸（补充图4A），从而引起醛脱氢酶结构域的改变，增加了2-AP的合成（补充图4B-E），因此可能代表该位点的功能性多态性。

除OsBADH2外，研究还发现了一个新的显著位点，命名为OsAROMA1。SNP vg0528473372（P = 7.92E−08）位于LOC_Os05g49620（OsWRKY19）下游（图2A）。进一步分析发现，SNP vg0528473372（A-T）与2-AP含量显著相关（图2C–2E）。该A/T替换位于一个微型倒位重复转座元件（MITE）/Tourist转座子中。RT-qPCR分析进一步验证了OsWRKY19的mRNA水平与水稻核心种质库中的2-AP含量一致。通过GC-MS和RT-qPCR，研究人员确认了MITE/Tourist转座子中的A/T替换改变了OsWRKY19的mRNA水平，进而调节OsBADH2的表达，最终影响了2-AP的含量。

为了研究OsWRKY19的功能，研究人员进行了跨物种系统发育分析，发现OsWRKY19与已知参与挥发性代谢物调控的转录因子（TFs）聚类（图3A）。亚细胞定位实验表明，OsWRKY19主要存在于细胞核中（图3B）。OsWRKY19的表达在营养组织中较高，而在稻谷成熟阶段逐渐下降，这一表达模式与公开的转录组数据中的OsBADH2相似。因此，研究人员推测OsWRKY19可能参与调控2-AP的生物合成。

研究人员构建了水稻粳稻品种ZH11背景下的OsWRKY19过表达系（OsWRKY19-OE）和oswrky19突变体系，并对水稻稻谷中的挥发性代谢物进行了检测。结果显示，OsWRKY19-OE系的2-AP含量增加，而突变体系的2-AP含量减少（图3C），且OsBADH2的表达在OE系中显著降低，在突变体系中显著增加（图3C）。感官分析表明，OsWRKY19-OE系的稻谷散发出适中的香气，而ZH11品种未检测到香气。

通过DNA亲和纯化测序，研究人员发现OsWRKY19的结合位点在启动子区域富集，且“TTGACC/T”核心序列是DAP-seq重复实验中最富集的基序。该核心序列是已知的W-box，是WRKY转录因子识别的基序。进一步的实验显示，OsWRKY19能够直接结合到OsBADH2启动子并抑制其活性（图3D和3E）。此外，电泳迁移率实验（EMSA）验证了这一结果（图3F）。除了调控香气，OsWRKY19还调节水稻的产量性状，表现出较优的农艺性状，如增加的粒长、千粒重和有效穗数（图3G、3H）。这些发现为水稻香气性状的改良提供了新的分子靶点。

除了研究2-AP的遗传变异外，研究人员还鉴定了多个与FAVs（挥发性脂肪酸）相关的遗传位点。研究表明，位于LOC_Os12g29330（OsNAC021）编码序列中的插入/缺失变异（indel，vg1217392211）与FAVs的含量显著相关，且FAVs的含量较高（图4E，4F和4G）。蛋白质建模显示，插入的氨基酸残基改变了OsNAC021蛋白的构象，可能导致其催化特性的变化（图4H和4I），从而影响OsNAC021的mRNA水平并促进FAV的积累（图4J和4K）。此外，在4367个水稻品种中，OsNAC021-H单倍型在芳香水稻中的频率高于粳稻或籼稻（图4L），提示这一变异可能经历了正向选择。跨物种系统发育分析表明，OsNAC021与已知参与挥发性代谢物调控的转录因子聚类（图5A）。亚细胞定位实验显示，OsNAC021-EGFP融合蛋白仅存在于细胞核中（图5B），提示其可能在转录调控中发挥作用。通过RT-qPCR分析，研究人员确认OsNAC021编码序列中的G/GCCC插入/缺失变异会导致OsNAC021 mRNA水平的变化。以上数据表明，OsNAC021是谷粒FAV变异的调控因子。

为了研究OsNAC021的功能，研究人员构建了12个过表达（OE）和10个突变体（mutant）品系，并选择了两个OE品系和两个突变体品系进行RNA测序分析。KEGG富集分析显示，突变体和OE品系的基因涉及到与FAV合成相关的通路。对OsNAC021-OE和osnac021突变体品系的稻谷进行挥发组分析和感官评估发现，osnac021突变体品系中FAV和茉莉酸的含量显著增加（图5C）。感官分析显示，osnac021突变体品系的稻谷散发出清新的香气，而ZH11品种则没有香气。综合来看，这些数据表明，转录因子OsNAC021负向调控水稻中FAV的积累。

OsNAC021是FAV的一个重要负向调控因子，但高FAV含量的品系并未表现出产量上的降低。从表型上看，osnac021-2品系的株高、穗长、谷粒宽度、分蘖数和千粒重与ZH11相比没有显著差异（图5D和5E）。虽然osnac021品系的谷粒长度和有效穗数显著高于ZH11，但每株的产量没有显著差异（图5D和5E）。

与ZH11相比，OsNAC021-OE品系中LOX途径基因的表达显著降低，反之亦然，这一点通过RT-qPCR得到了验证（图5C）。酵母单杂（Y1H）实验结果显示OsNAC021与OsADH1和OsADH2的启动子在酵母中发生了相互作用（图6A和6B）。EMSA实验也证实了OsNAC021与OsADH1、OsADH2和OsLOX9启动子中的NACRS基序相互作用（图6C–6E）。此外，在水稻原生质体和烟草叶片中的双荧光素酶报告基因实验表明，OsNAC021显著抑制了这些启动子的活性（图6F–6I），表明OsNAC021是LOX途径的负向调控因子。综上所述，OsNAC021通过LOX途径负向调控FAV的积累，并且突变体品系在没有产量降低的情况下过度积累谷粒中的FAV。

为了研究OsNAC021与2-AP的关系，研究人员使用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）检测OsNAC021转基因水稻中的2-AP含量。结果显示，在OsNAC021转基因水稻中未检测到2-AP，并且OsBADH2的表达水平没有变化。Y1H实验也表明，OsNAC021与OsBADH2启动子没有相互作用。

研究人员通过喂食实验研究了麻雀对水稻中2-AP和FAVs的偏好。结果显示，OsWRKY19-OE和osnac021种子比ZH11种子更能吸引麻雀停留和觅食，且oswrky19和OsNAC021-OE种子在吸引力上没有显著变化。这表明2-AP和FAVs不仅是人类香气的关键成分，也受到麻雀的喜爱。研究结果进一步揭示，OsWRKY19和OsNAC021分别调控2-AP和FAVs的合成，最终决定了特定水稻品种是否会被人类和鸟类视为具有吸引力的食物来源（图7）。

OsWRKY19和OsNAC021的发现为水稻香气改良提供了重要的遗传资源。这项研究为通过基因编辑育种来提高2-AP和FAV的产量提供了理论基础，推动了芳香水稻产业的创新和进步。