PC|WRKY33负调控花青素的生物合成，并与PHR1协同介导对缺磷的适应机制

科技 2024-11-11 22:54 北京

2024年1月16日，浙江省农业科学院洪高洁团队在Plant Communications上在线发表了题目为“WRKY33 negatively regulates anthocyanins biosynthesis and cooperates with PHR1 to mediate the acclimation to phosphate starvation”的论文。研究发现转录因子WRKY33是花青素合成的负调控因子，植物利用Pi饥饿信号解除WRKY33的限制，积累花青素，适应缺Pi胁迫。

研究背景

磷是一种必需的常量营养素，参与植物的重要生物过程。而土壤中有效磷十分有限，缺磷是降低植物生产力的最常见的营养缺乏症之一。随着时间的推移，植物已经进化出许多Pi饥饿响应机制来适应低磷胁迫。此外，磷饥饿可以改变植物次生代谢物的生物合成，尤其是花青素的生物合成。花青素是由花青素和糖通过糖苷键形成的糖苷衍生物；它们在植物生长和抗性中具有多种功能，包括引诱传粉者和种子传播者，屏蔽植物免受紫外线辐射，影响生长素运输，以及在逆境条件下清除自由基。先前有研究表明，部分WRKY转录因子受磷胁迫影响，在植物生长发育以及响应生物和非生物胁迫中的发挥重要作用。WRKY33是一类包含WRKY结构域的转录因子，已被证明在抵抗生物和非生物胁迫中发挥重要作用。然而，WRKY33在非生物胁迫下影响次生代谢物生物合成的机制，特别是在缺乏pi的条件下，受到的关注较少。花青素积累被认为是磷酸盐（Pi）饥饿的表型指标。然而，这一过程的负调节因子及其分子机制在很大程度上仍未被探索。该论文发现转录因子WRKY33是花青素合成的负调控因子，植物利用Pi饥饿信号解除WRKY33的限制，积累花青素，适应缺Pi胁迫。

研究结果

WRKY33抑制pi饥饿诱导的花青素积累

KEGG通路富集分析显示，WRKY33调控的基因在苯丙类生物合成、类黄酮生物合成和花青素生物合成中显著富集（图1A）。因此，我们测定了野生型（Columbia [Col-0]）、wrky33突变体和WRKY33过表达（WRKY33OE）拟南芥植株在+Pi和-Pi条件下的类黄酮和花青素含量。与之前的报道一致，磷饥饿显著诱导黄酮类和花青素的积累。然而，在-Pi条件下，wrky33突变体的花青素含量明显高于Col-0，而WRKY33OE植株的花青素含量则比Col-0低50%（图1B和1C）。这些结果表明，WRKY33参与花青素的生物合成而不是类黄酮的生物合成。

许多基因参与花青素的生物合成，包括查尔酮异构酶（CHI）、查尔酮合成酶（CHS）和二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）。DFR催化花青素生物合成的第一步，对磷缺乏和磷恢复条件敏感。在这三个基因中，DFR的表达模式与WRKY33相关突变体中花青素含量的变化模式相似（图1D和1F）。这表明WRKY33抑制拟南芥缺磷诱导的DFR表达和花青素积累。

图1 WRKY33抑制pi缺乏诱导的拟南芥花青素生物合成。

WRKY33直接或间接调控DFR的表达

WRKY转录因子特异性结合W box调控下游基因的表达。分析DFR启动子发现它包含两个W盒（图2A）。酵母单杂交实验显示，WRKY33直接与DFR启动子结合，但当DFR启动子的W1和W2发生突变时，WRKY33不能与DFR结合（图2B）。电泳迁移量测定（EMSA）显示，WRKY33与DFR启动子的W1和W2结合（图2C）。这些结果表明WRKY33直接与DFR启动子结合。

为了探索参与WRKY33调控花青素合成的其他转录因子，通过酵母双杂交（Y2H）实验中鉴定出一个与WRKY33相互作用蛋白PAP1（图2D）。PAP1是调控花青素生物合成的关键TF，可直接结合DFR启动子激活DFR表达。通过双分子荧光互补（BiFC）实验证实了烟草叶片中WRKY33和PAP1的相互作用，PAP1- nYFP和WRKY33- cYFP的共表达在细胞核中产生荧光信号（图2E）。在花青素生物合成过程中，PAP1在MBW复合物组分中起着中心正调节作用。利用Y2H实验分析WRKY33影响MBW复合物的机制，结果显示WRKY33与PAP1相互作用，但不与TT8或TTG1相互作用（图2F）。接下来，酵母三杂交（Y3H）实验表明，WRKY33影响MBW复合物的形成（图2G）。以PAP1、TT8、TTG1和WRKY33作为效应物进行双荧光素酶（dual-LUC）实验，与MBW复合物（PAP1、TT8和TTG1）共表达后，DFR启动子的LUC活性比对照提高了4.6倍。WRKY33抑制MBW复合物对DFR启动子的激活作用达43%（图2H和2I）。这些结果表明WRKY33可能影响MBW复合物，间接抑制其对DFR启动子的激活。综上所述，我们的研究结果表明WRKY33以直接和间接的方式调节花青素的生物合成。

图2 WRKY33直接或间接调控DFR的表达。

WRKY33对DFR启动子的结合亲和力在Pi饥饿下减弱

为了进一步研究WRKY33在不同Pi条件下影响DFR表达和花青素生物合成的调控机制，研究人员对拟南芥WRKY33- OE（带黄色荧光蛋白[YFP]标签）进行了染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR），比较了WRKY33在Pi充足和Pi饥饿条件下对DFR启动子的DNA结合能力。在Pi充分条件下，WRKY33结合到包含两个W-box的DFR启动子区域。然而，这种结合在Pi饥饿条件下被抑制（图3A）。为了确定为什么在Pi充足和Pi缺乏条件下，DFR启动子上WRKY33的富集程度不同，研究人员检测了在+Pi和- Pi培养基上生长的Col-0和WRKY33- YFP植株的WRKY33蛋白水平。Western blot结果显示，缺Pi条件下WRKY33-YFP蛋白水平降低（图3B）。研究人员观察植物从充足pi培养基转移到缺乏pi条件下72小时后的WRKY33信号，结果显示，在pi缺乏培养基中生长的植物表现出较弱的荧光信号（图3C和3D）。这些结果表明，在−Pi条件下，WRKY33蛋白水平和DFR启动子上WRKY33的富集程度都降低了。

图3 在Pi饥饿下，DFR启动子上WRKY33的富集减弱。

PHR1参与WRKY33对DFR的pi依赖性调控

由于在Pi充足和Pi缺乏的条件下，WRKY33对DFR表达的调控完全不同。Y2H实验显示WRKY33与PHR1相互作用，但不与SPX1-4相互作用（图4A）。BiFC和共免疫沉淀实验证实了WRKY33和PHR1在体外和体内的相互作用（图4B和4C）。与+Pi条件相比，−Pi条件下WRKY33蛋白水平在PHR1突变体中几乎没有下降，但在Col-0背景下WRKY33蛋白水平显著下降（图4B和4E）。为了确定PHR1突变是否促进WRKY33丰度，研究人员检测了MG132对WRKY33稳定性的影响。Western blot分析显示，在+Pi条件下，MG132处理后WRKY33丰度增加（图4F）。为了进一步测试WRKY33的稳定性，研究使用环己亚胺（CHX）阻断新蛋白的生物合成。WRKY33在phr1突变体中与Col-0植株相比，周转率降低（图4G）。在+Pi或−Pi条件下，Col-0、phr1、WRKY33OE和phr1 WRKY33OE植株的花青素积累也有所增加。结果表明，phr1和WRKY33OE植株花青素积累量均下降。这些结果表明，PHR1的突变增加了WRKY33蛋白的稳定性，并且PHR1参与了影响WRKY33蛋白周转的因素的调控。

图4 PHR1参与WRKY33对DFR的pi依赖性调控。

PHR1可减弱WRKY33对花青素合成的抑制作用

研究结果表明WRKY33与PHR1有物理关联，它们在花青素生物合成的调节中起作用。为了了解WRKY33和PHR1是否在花青素生物合成中相互作用，研究构建了wrky33 phr1双突变体。wrky33 phr1的花青素含量高于phr1，但低于wrky33（图5A）， DFR表达水平与这些表型一致（图5B和5C）。

图5 WRKY33与PHR1的遗传互作

将WRKY33OE与PHR1OE杂交，得到WRKY33OE PHR1OE植株，并分析WRKY33对PHR1的调控作用。与Pi缺乏条件下的WRKY33OE PHR1OE植株相比，WRKY33OE植株花青素积累和DFR表达增加，表明PHR1可能减弱WRKY33对花青素合成的抑制作用（图6A-6C）。

图6 PHR1可以减弱WRKY33对花青素产生的抑制作用。

评述

当面临Pi饥饿时，为了维持生长，植物会触发一系列主要受转录水平控制的适应性反应。花青素在植物中广泛产生，其生物合成对多种生物和非生物胁迫敏感。长期以来，人们一直认为植物在Pi饥饿条件下会产生过量的花青素。但是花青素产生原因及具体机制并不明晰。研究发现，在+Pi条件下WRKY33通过直接结合DFR启动子或与PAP1相互作用来抑制花青素的生物合成；在−Pi条件下，PHR1与SPXs的相互作用被削弱，PHR1得以释放发挥其功能。释放的PHR1与WRKY33相互作用，抑制WRKY33与DFR启动子的结合。同时，WRKY33蛋白水平下调，其对DFR的抑制作用进一步减弱。最终，WRKY33对花青素生物合成的抑制被抑制，导致在Pi缺乏条件下花青素积累（图7）。简单来说，WRKY33本身作为磷状态依赖性花青素生物合成的负调节因子存在。Pi饥饿抑制了花青素生物合成抑制因子WRKY33，从而精细地调节了花青素的生物合成。这种依赖磷状态的花青素生物合成的“负负得正”调节模式是在适应Pi饥饿期间维持植物代谢稳态所必需的。

图7 WRKY33调控的拟南芥中依赖磷状态的花青素生物合成模型。

评述｜张笑晗

编辑｜史文成

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xplc.2024.100821

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