2024年10月4日，青岛农业大学梁文星团队在Nature Plants上在线发表了一篇题为“Plant PR1 rescues
condensation of the plastid iron-sulfur protein by a fungal effector”的研究论文，揭示了尖孢镰刀菌效应子FolSvp2以相分离依赖的方式发挥作用及其被宿主防御蛋白PR1抵御的分子机制。
土传病原菌尖孢镰刀菌(Fusarium
oxysporum)是十大真菌类植物病原菌之一，是120多种植物的维管束枯萎病的病原，给农业生产和世界经济造成严重损失。植物病原菌通过分泌大量的效应蛋白来促进侵染，但是这些毒性蛋白是否会发生相分离以调控植物的防御反应以及寄主是如何应对这一事件的仍不清楚。研究者通过质谱鉴定，发现FolSvp2在第205位赖氨酸残基处被乙酰化（图1a）。为了确认FolSvp2的修饰状态，研究者将K205突变为谷氨酰胺( Q )或精氨酸( R )，分别模拟赖氨酸的乙酰化( FolSvp2Q )或非乙酰化( FolSvp2R )形式。随后研究者使用针对FolSvp2乙酰化K205位点的定制抗体(anti-K205ac)进行了western blot分析，结果发现，在菌丝中检测到WT FolSvp2的信号，但没有检测到FolSvp2Q或FolSvp2R的信号(图1b、c )，表明K205确实在真菌细胞中被乙酰化。研究者构建了FolSvp2敲除突变体(∆FolSvp2)及其遗传互补菌株(∆FolSvp2-C)并进行了侵染试验，结果发现，将K205突变为Q (∆FolSvp2-CQ)对致病力影响不大，而将该残基突变为R (∆FolSvp2-CR)则会损害Fol的毒力(图1d、e )，表明K205乙酰化对于FolSvp2介导的毒力至关重要。为了进一步确定K205乙酰化的作用，研究者在组成型RP27启动子的控制下表达了带有C端GFP融合的K205突变体。WB分析表明，R突变体在菌丝中的丰度约为WT或Q突变体FolSvp2的20 %，并且R突变体FolSvp2的分泌量显著降低(图1f )。因此，在感染WT或Q突变体FolSvp2 - GFP菌株的番茄根中，在根细胞中观察到明显的GFP信号，而FolSvp2R蛋白在被该菌株侵染的根中没有检测到(图1g )。这些结果表明Fol分泌的FolSvp2被转运到植物细胞中，并且K205乙酰化对FolSvp2的积累至关重要。K205的乙酰化修饰可以稳定效应蛋白FolSvp2鉴于FolSvp2R突变体在Fol中的积累减少，研究者推测K205去乙酰化可能导致该蛋白的降解。添加MG132后，FolSvp2R - GFP的积累量提高了4倍(图2a)，并且通过使用抗泛素抗体的WB分析检测到了泛素化形式(图2b)。然而，MG132处理对FolSvp2 - GFP或FolSvp2Q - GFP几乎没有影响(图2a)，表明在番茄根系存在的情况下，WT蛋白被大量乙酰化(图1c)。为了鉴定FolSvp2R的泛素化位点，用anti - GFP琼脂糖珠拉下FolSvp2R - GFP进行质谱分析，共鉴定出两个泛素化赖氨酸残基K107和K215。突变K107或K215分别使FolSvp2R - GFP的量增加了1.8和2.9倍(图2c)，而同时突变这两个残基( FolSvp23R-GFP )使FolSvp2R- GFP在菌丝体中的量增加到与FolSvp2Q - GFP (图2c)和FolSvp2 -
GFP (图2d)相同的水平。因此，与FolSvp2R - GFP相比，FolSvp23R - GFP的分泌量显著增加(图2e)，并且该蛋白现在可以在被感染的根细胞中检测到(图2f)。FolSvp23R完全恢复了∆FolSvp2突变体(图2g, h)的毒力表型，进一步证实了FolSvp2稳定性在Fol毒力中的重要性。这些发现表明，K107和K215的泛素化导致26S蛋白酶体介导的FolSvp2的降解，而K205的乙酰化通过阻止泛素化来稳定该蛋白，使FolSvp2有助于Fol的毒力（图2i）。为了探究FolSvp2的致病机制，研究人员在本氏烟叶片中瞬时过表达FolSvp2 - GFP，发现FolSvp2 - GFP在有或没有其天然SP的情况下特异性地聚集在点状凝集物中(图3a)，但不在细胞核中。虽然K205突变对FolSvp2的凝集没有影响(图3a)，但Q突变体的凝集量是WT和R突变体FolSvp2的~ 3.5倍(图3b)。研究者进一步对FolSvp2进行质谱分析，鉴定到1个泛素化残基K215。用R替换K215使FolSvp2R - GFP的水平恢复到FolSvp2Q - GFP的水平，而K107 R突变对FolSvp2R的量几乎没有影响(图3c)。这些结果表明，K205乙酰化有效地阻止了植物中瞬时泛素化的FolSvp2的积累，而FolSvp2的积累受26S蛋白酶体介导的降解。研究人员在番茄叶片和根中检测到了FolSvp2 - GFP的凝集体，而不是GFP本身。此外，在植株中观察到FolSvp2 - GFP凝集体的融合(图3d )，并对点状体进行了光漂白后的荧光恢复( FRAP )（图3e, f）。为了研究FolSvp2在体外是否具有形成凝聚体的倾向，将纯化的FolSvp2 - GFP和GFP分别用或不用10%的聚乙二醇( PEG )进行重组，发现在PEG的存在下，只有FolSvp2 - GFP凝聚体被观察到(图3g, h)。这些结果表明FolSvp2在宿主细胞内经历相分离形成凝集体。去除IDR1或IDR3导致观察到稍稀疏的凝集物，而缺失IDR2的FolSvp2不能形成凝集物，而是分布在细胞质和细胞核(图3h-k)中。因此，去除IDR2而不是IDR1或IDR3导致Fol毒力显著降低(图3l, m)。总的来说，这些数据表明IDR2依赖的相分离对于Fol侵染至关重要。图3 乙酰化和相分离增强了FolSvp2在植物中的稳定性FolSvp2将质体SlISP转运到效应子凝集体中为了确定FolSvp2在Fol侵染中的功能，研究者进行了Y2H筛选实验，鉴定了18个候选FolSvp2互作蛋白。选取鉴定频率最高的蛋白之一SlISP进行下一步研究。qRT-PCR分析表明，SlISP转录本在多个组织中积累(图4a )，Fol侵染后SlISP在根中表达上调(图4b )。为了评估SlISP在番茄抗性中的功能，研究者利用CRISPR - Cas9系统构建了3个SlISP缺失突变体和3个SlISP过表达植株。侵染试验结果表明，SlISP在番茄防御反应中起着正向的作用，因此SlISP可能是FolSvp2的一个靶标。为了验证FolSvp2与SlISP的相互作用，研究者进行了Y2H和Co - IP分析（图4c, d）。虽然SlISP是一个质体定位蛋白，但双分子荧光互补( BiFC )分析检测到其与FolSvp2在凝集体中存在互作。一个可能的解释是FolSvp2可以通过直接结合的方式改变SlISP的亚细胞定位。为了验证这种可能性，研究者在烟草叶片中瞬时表达SlISP - RFP (红色荧光蛋白)，发现FolSvp2 - GFP的共表达导致在凝集物中观察到前一个蛋白(图4e )。因此，SlISP - RFP在叶绿体中的积累显著减少(图4f )。而添加与SlISP相关的IDR2突变体FolSvp2 - GFP并没有改变前者的亚细胞定位。在ΔFolSvp2和FolSvp2-OE菌株侵染后，质体中SlISP的积累分别增加和减少(图4g )。这些结果表明，FolSvp2通过直接互作将SlISP从质体转运到效应子凝集体。为了检测SlISP在植物防御中的作用以及FolSvp2对SlISP的定位效果，研究者进行了一系列的番茄侵染实验（图4h-k）。结果表明，SlISP被FolSvp2转运到效应蛋白凝集体中，减少了H2O2的产生，并消除了其对植物抗性的贡献。图4 FolSvp2将SlISP转移到效应蛋白凝集物中以促进Fol毒力在Y2H筛选中，SlPR1作为番茄抵抗病原菌侵染的关键组分，也被鉴定为FolSvp2的候选结合蛋白。Y2H (图5a)和Split - luciferase( LUC ) (图5b, c)分析证实，FolSvp2特异性地与SlPR1相互作用，但不与包括SlP14b在内的其他假定PR1蛋白相互作用。体内BiFC分析结果表明，FolSvp2与SlPR1在胞外空间存在互作，而与SlP14b不存在相互作用。为了探究胞外SlPR1和FolSvp2如何影响彼此的功能，研究者在植物中进行了共表达。加入WT或CAPE1缺失的SlPR1均导致效应子凝聚体消失，而SlP14b的存在对FolSvp2在细胞质中的积累没有影响(图5f, g)。同样，在BiFC分析中，当在胞外区检测到SlPR1和FolSvp2的结合时，在细胞质中没有观察到凝聚体。一个可能的解释是，质外体SlPR1可以通过直接相互作用阻止FolSvp2进入细胞质。为了验证这种可能性，研究者将纯化的FolSvp2 - GFP与番茄根原生质体共孵育，观察到该蛋白的吸收率为37 %。然而，加入WT或CAPE1缺失的SlPR1后，FolSvp2在细胞质中的积累量降低至~ 10 % (图5h, i)。为了确定SlPR1是否通过阻断FolSvp2的易位来增强番茄的抗病性，研究者进行了接种试验。SlPR1或SlPR1ΔCAPE1的过表达在很大程度上消除了FolSvp2在寄主细胞中的积累，并恢复了质体中SlISP的水平(图5j )，从而增强了对病原菌的抗性(图5k, l)。总的来说，这些结果表明SlPR1抑制FolSvp2进入植物细胞，并阻止FolSvp2介导的SlISP的易位，从而消除其对真菌毒力的贡献。图5 SlPR1抑制FolSvp2向宿主细胞的转移为促进侵染，病原菌通常编码成百上千种毒力效应子并部署到植物细胞中。在长期进化过程中，植物也进化出了相应的防御机制。本研究揭示了尖孢镰刀菌效应子FolSvp2发挥作用及其被宿主防御蛋白PR1抵御的分子机制—FolSvp2发生相分离，将质体SlISP劫持到植物细胞内的效应子凝集体中，减少宿主ROS的产生，而番茄SlPR1在质外体中与FolSvp2相互作用，并阻止其进入宿主细胞（图6）。本研究为病原菌和植物之间的“军备竞赛”提供了一个鲜明的例子和研究思路，为抗枯萎病育种提供了理论参考。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41477-024-01811-y
