2024年11月，爱荷华州立大学Dior Kelley团队和Justin Walley团队合作的研究论文“Quantitative proteomics reveals extensive lysine ubiquitination and transcription factor stability states in Arabidopsis”在the Plant Cell期刊上提前在线发表，该研究发布了拟南芥根、幼苗和莲座叶的赖氨酸泛素化修饰信息，并实验验证泛素化影响部分转录因子的蛋白稳定性和生物功能。
研究背景
泛素化是一种广受关注的蛋白翻译后修饰，其主要发生在蛋白质的赖氨酸残基上，常通过泛素-26S蛋白酶体（UPS）系统介导蛋白质降解，对植物的多数生物学过程都有所影响。随着蛋白质组学的发展，近年来有一系列研究都在关注如何更好的鉴定植物中的泛素化蛋白，目前通过diGly-抗体富集是广受认可的。该研究通过diGly-抗体富集后TMT标记定量和非标记定量多种方法对拟南芥进行了检测。
研究内容
拟南芥中泛素修饰蛋白的检测定量方法对比
研究者首先测试了影响diGly-抗体富集的半胱氨酸烷基化、抗体用量等步骤（图1A-1C），确定肽段富集方法。然后用26S蛋白酶体抑制剂BTZ处理10d龄Col-0拟南芥主根为材料，测试发现先富集再TMT标记是有效的工作流程（图1D）。随后对比先富集再TMT标记、先富集再TMTpro标记以及DDA非标记分析的效果，发现三种流程分别鉴定到2944、2853以及3955个位点（图1E），考虑到标记定量在限制缺失值等方面的优势，研究者认为富集结合标记定量也是一种有效的植物泛素化修饰组检测方法。
图1 测试各种泛素化检测方法
拟南芥根、幼苗和叶的泛素化修饰组
除10d龄Col-0拟南芥主根外，研究者又对拟南芥10d龄幼苗和3周龄莲座叶进行了非标记2D-LC-MS/MS分析（也进行了100 μM BTZ处理）。幼苗和莲座叶分别鉴定到10093和8286个位点。综合以上所有测试鉴定方法的结果，最终该研究共鉴定到三种组织共6453个泛素化蛋白的17940个赖氨酸泛素化位点，覆盖了广泛的生物学过程（图2A、2B）。
图2 拟南芥根、幼苗和叶泛素化修饰组
识别潜在的泛素-26S蛋白酶体（UPS）底物
根是研究基因表达调控的关键器官，而通过26S蛋白酶体进行的蛋白质周转与根的生长发育调控有关，因此研究者又通过BTZ以及mock处理的拟南芥根蛋白组和修饰组数据分析了潜在的UPS底物。分析修饰数据发现691个蛋白质上的1336个位点在BTZ处理后表达量提高。而分析蛋白水平发现213个蛋白质在BTZ处理后丰度增加。联合两者发现有104个蛋白既检测到修饰，又在BTZ处理后表现出蛋白水平提高，研究者认为这些是有较高置信度的UPS底物（图3A、3B）。这104个蛋白中的确有几个是此前报道过与UPS降解相关的。
还有些蛋白存在泛素化位点，但BTZ处理后蛋白质丰度反而降低，研究者将其解释为可能通过溶酶体或自噬等途径降解。
图3 鉴定潜在的UPS底物
对泛素化肽段进行motif分析
此前关于蛋白质降解相关的泛素化结构域（降解子）的研究发现泛素化也存在一些保守的氨基酸基序，因此该研究也分析了拟南芥中的泛素化基序，以赖氨酸前后各7个氨基酸为窗口进行分析，共发现27个显著富集的基序，其中D、E、A和G是泛素化赖氨酸周围最常见的氨基酸。
分析根中BTZ处理后表达量提高的1336个位点，发现QK基序的富集，而对照组数据未出现QK富集（图4A）。GO分析发现，含有QK基序的蛋白质参与对植物生长调节剂的响应等过程，在转录因子分子功能方面也有显著富集（图5B）。
图4 对BTZ处理导致表达量提高的泛素化位点进行基序分析
根中大量转录因子存在泛素化修饰，且影响其蛋白稳定性
分析发生泛素化的蛋白质类别后，研究者发现其中存在大量转录因子，共包括40个转录因子家族的成员（图5A）。这些转录因子泛素化位点的揭示将有助于其功能研究，该研究中挑选了几个具有单一泛素化位点且可获得全长克隆的转录因子为例进行探索，希望通过实验证明泛素化影响了这转录因子的蛋白稳定性。
研究者通过基于荧光素酶的降解测定监测蛋白稳定性，首先将K位点突变为R位点模拟去泛素化修饰，将原序列与突变序列都融合荧光素酶并转化本氏烟草，并在环己亚胺处理后随时间测定蛋白质丰度（环己亚胺为翻译抑制剂，能抑制蛋白质合成）。相较未突变蛋白，模拟去泛素化的突变蛋白降解速度明显减慢了，这表明泛素化修饰对其蛋白质周转相当重要。
图5 泛素化转录因子的分析
CIB1的K166位点泛素化可能影响拟南芥开花时间
CIB1是bHLH家族成员，其与CRY2互作，正调控FT并促进开花。此前有报道称其可被26S蛋白酶体降解，但并不清楚泛素化位点。研究者在拟南芥根、幼苗和叶中都检测到其K166位点发生泛素化，且降解实验也证实了，该位点影响CIB1的蛋白稳定性，因此希望通过植物体内实验进一步验证其功能。
研究者通过CRISPR/Cas9获得CIB1的K166位点突变为R166的突变体株系cib1-3（图6A）。表型观察发现短日照时cib1-3的开花时间明显早于WT（图6B、6C），FT表达水平也有相应变化（图6D），同时cib1-3中CIB1的mRNA水平与WT类似（图6E）。这些结果表明，K166R突变导致CIB1蛋白水平增加，进而激活FT并影响开花。不过长日照条件下cib1-3和WT没有明显差异。总之，CIB1的K166位点泛素化可能介导其影响开花时间。
图6 抑制CIB1的K166位点泛素化可促进开花
评述
该研究结合多种泛素化组学检测方法，汇总获得了相当广泛的拟南芥泛素化位点信息，这些信息能为今后植物中修饰介导生物过程的研究提供助力。该研究中也用转录因子稳定性的实验提供了示例。随着组学技术的进步，研究者对植物蛋白修饰的理解范围会不断扩展。
原文链接：https://doi.org/10.1093/plcell/koae310
END
评述：李凤仪
编辑：何宇飞
Niu Lab
林木科学评论
