研究背景
杂种优势目前已被广泛用于提高诸多作物产量、品质和环境适应性。油菜（Brassica napus）是全球第三大油料作物，代表了杂种优势最成功的应用之一。杂种优势的广泛应用是油菜种子生产迅速的重要原因。现今，油菜竞争制种中的不育类型主要是细胞质不育（CMS）和核不育(GMS)。
研究结果
通过精准编辑不同优良亲本系中的BnaMS1和BnaMS2基因有效产生隐性核不育（RGMS）系。
利用两条特异性引导RNA（sgRNA），对BnaMS1和BnaMS2基因进行敲除突变，以精确靶向这两个基因的初始外显子，从而确保基因成功断裂并引发移码突变（图1A）。研究者成功构建了pSH94双元载体，该载体包含由2×35S启动子驱动的Cas9以及两个sgRNA（图1B）。从优良亲本系中成功培育出了多种无T-DNA插入的BnaS1和BnaS2单基因和双基因纯合突变体（图1C）。
在植物开花期间，突变体的株高与WT相似（图 2A-B）,然而，双突变体的花瓣面积与WT相比平均减少了8.9%（图 2C-F）。此外，雄蕊比WT的雄蕊短约4mm（图 2G-J,O-P）。结果显示，不同遗传背景的所有双突显示完全雄性不育，具有小花药、较短的花丝，并且在成熟花药中未见花粉（图2G-L）。
图1 利用CRISPR/Cas9技术创建BnaMS1和BnaMS2功能缺失突变体。
图2 BnaMS1和BnaMS2基因突变影响植物的育性。
油菜分子育种中不同可视化报告基因的开发与鉴定
为了实现高效快速筛选隐形核雄性不育系S45A，通过构建三种携带功能性BnaMS1基因与不同报告基因（DsRed、BnaA07.PAP2和RUBY）相连的SPT载体，并在亲本系ZY50中进行了测试，并由CaMV35S启动子驱动，用于标记转基因种子或幼苗。在原生启动子下的BnaMS1能够恢复BnaMS1/BnaMS2双突变体的雄性繁殖能力（图 3A-C）。在温室和田间环境下测试RUBY系统，在转基因的过程中，整株转基因植物中表现出非常明显和稳定的RUBY红色，且在组织培养、幼苗和成株阶段都能清晰区分转基因植株和非转基因植株，验证了该系统的可行性与高效性（图 4）。
图3 视觉报告系统示意图。
图4 野生型和转基因油菜植物的表型分析。
筛选和鉴定理想的PMR报告细胞系
PMR是指一种基于RUBY报告基因的转基因表达盒（Pigment
Marker with RUBY）。SPT系统是指“种子生产技术”（Seed
Production Technology）,是一种用于杂交作物种子生产的系统。
通过实施SPT系统的设计概念，筛选出理想的转基因保持系。该保持系应具有明显的红色表型，且携带单拷贝半合子T-DNA插入，该插入包含PMR报告基因和功能性BnaMS1基因，同时携带无Cas9的纯合BnaMS1BnaMS2等位基因。通过筛选ZY50背景下生成的PMR T0转基因植株中红色表型明显且携带单拷贝半合子T-DNA的SPT株系，并结合后代苗期颜色分离比的表型鉴定，最终获得理想的PMR-28 T0转基因材料。
在PMR-28的T1代中，44株植物中有32株表现为红色，12株是绿色，符合3:1的单基因分离比（图 5B）。通过反向PCR和全基因组重测序技术，成功分离出PMR-28中的T-DNA插入侧翼序列。T-DNA插入位点被精确定位在chrC08染色体的37703371位置，恰好位于BnaC08g44490D和BnaC08g44500D两个基因间的间隔区域（图5A）。后续表型分析说明，红色幼苗为杂合/纯合基因型，而绿色幼苗为野生型基因型（图 5C/D）。进一步量化了F2代个体提取物的吸光度，以测定甜菜红素的含量。分为两组：吸光度增加的红色幼苗（纯合子个体）和吸光度降低的粉红色幼苗（杂合子个体），这表明RUBY基因的纯合/杂合插入具有显著的剂量效应（图5E）。
图 5 RUBY基因的同源/杂合插入对幼苗颜色的累积效应。
评述
该研究成功建立了一种通过靶向突变BnaMS1/ BnaMS2基因，并结合RUBY可视化报告系统，开发了一种适用于油菜杂交种子生产的高效两系育种系统。该系统在油菜中的保持系与不育系的杂交后代种子可以通过颜色快速区分，从而提高杂交种子生产的效率。这为未来油菜的基因功能研究和两系杂交育种提供了可靠的手段。同时也为后续研究一些难以进行两系杂交育种的植物物种提供了重要的参考。
END
评述：李京京
编辑：赵一梅
