Mol. Plant | 揭示TT1-SCE1 模块调节水稻耐热性的分子机制

ONE

热应激对粮食产量构成重大威胁。之前的研究确定编码 26S 蛋白酶体的 α 2 亚基的 TT1 是水稻耐热的关键调节因子，代表了作物耐热的第一个克隆 QTL。然而，TT1 介导的机制仍然难以捉摸。在这项研究中，研究人员揭示了 SUMO 结合酶 1 （SCE1），它与 TT1 相互作用并作为 TT1 的下游组分，参与 TT1 介导的 26S 蛋白酶体降解。SCE1 作为耐热性的负调节因子发挥作用，可与泛素化修饰有关。此外，研究人员观察到 HSP （如 Hsp24.1 和 Hsp40）可以经历 SCE1 介导的 SUMO 化，导致在没有 SCE1 的情况下 sHSP 的积累增加。此外，研究人员提出由 SCE1 调节的全局 SUMOylation 是响应热应激的关键信号，由于 SCE1 基因功能的丧失，升高的 SUMOylation 的快速下降被认为是增强耐热性的积极作用。降低 SCE1 蛋白水平通过提高结实率和水稻籽粒灌浆能力，显著提高高温胁迫下籽粒产量。最终结果揭示了 SCE1 在 TT1 介导的耐热途径中的关键作用，调节 sHSP 蛋白和 SUMO 化的丰度，并最终影响水稻的耐热性。这些发现强调了 TT1-SCE1 模块在提高作物耐热性方面的巨大潜力。

OsSCE 是否对热应激有反应并参与作物耐热应激的期刊预证明信号通路？

TWO

1、SCE1 与 TT1 结合并充当耐热性的负调制剂

研究人员将 CG14 （非洲水稻种质） 的 TT1 编码序列克隆到 pGBKT7 载体中，作为筛选与 TT1 相互作用的蛋白质的诱饵。采用酵母双杂交文库筛选方法确定了 100 多种候选蛋白，重点是 SUMO E2 结合酶 SCE1。最初使用酵母双杂交 （Y2H） 测定与体外含有全长 CDS 和沉降测定的载体确认TT1 和 SCE1的直接物理相互作用（图 1A 和 B）。此外，以免疫共沉淀 （Co-IP） 和分裂萤火虫荧光素酶互补 （SFLC） 测定提供额外证据（图 1C-D 和补充图 1A）。亚细胞定位分析显示 TT1 和 SCE1 在细胞内全局定位，双分子荧光互补 （BiFC） 测定显示强荧光信号定位于细胞质和细胞核，指示蛋白质期刊 这些细胞内 nYFP-SCE1 和 TT1-cYFP 之间形成的预证明在本氏烟草叶细胞的这些细胞区室内（图 1E）。

研究人员使用 CRISPR/Cas9 技术和 SCE1 （SCE1-OE） 的过表达系来验证 SCE1 响应热应激的生物学功能，在水稻品种 'WuYunJing7' （WYJ） 背景下生成转基因敲除系 （sce1-ko） 和 SCE1 （SCE1-OE） 过表达系。在幼苗期进行热处理后，与 WYJ 相比，sce1-ko 品系表现出增强的生长和更高的存活率（图 1F、1H 和补充图 1C）。相反，SCE1-OE 在热处理后显示 SCE1 的转录水平升高，存活率低于 WYJ（图 1G、1F、1I）。在幼苗和成熟阶段，sce1-ko 或 SCE1-OE 品系与 WYJ 之间未观察到生长的显着差异，包括分蘖数和株高（图 1F）。尽管拟南芥 sce1 突变体表现出发育停滞和胚胎致死性，但研究人员没有观察到水稻 sce1 突变体有任何显着的生长缺陷。猜测可能是由于同源基因 OsSCE2 和 OsSCE3 的功能补偿，它们确保了 sce1-ko 的正常生长。多序列比对和系统发育分析表明，OsSCE1、OsSCE2、OsSCE3、AtSCE1 和其他同源物具有显着的序列相似性，并且在整个进化过程中高度保守。此外，通过 qRT-PCR 分析确定，与根、芽和幼穗相比，SCE1 在叶片中的表达水平显着更高。综上，这些发现证实CE1 与 TT1 密切相关，并作为热应激的负调节因子。

2、TT1 靶向 SCE1 进行 26S 蛋白酶体介导的降解

研究人员使用抗 SCE1 抗体进行免疫印迹分析，以检测内源性 SCE1 蛋白水平。结果显示，随着热处理的进行，SCE1 蛋白丰度降低（图 2A）。此外，TT1 的蛋白质水平随着长时间的热处理而逐渐积累（补充图 5A）。免疫检测结果显示 SCE1-OE 中多泛素化 SCE1 的水平增加，抗泛素和抗泛素-K48 抗体证实了这一点（图 2B）。抗 unbiquitin-K63 免疫印迹结果显示，SCE1 受 K63 连接的泛素化最小修饰。由于 K48 连接的泛素化通常与 26S 蛋白酶体降解途径有关，因此 SCE1 极有可能主要经历 26S 蛋白酶体介导的降解，因为 K48 连接的泛素化在 SCE1 中占主导地位。

该研究检查了 TT1 转基因品系中 SCE1 的相对丰度。与 WYJ 相比，在 TT1 （tt1-ko） 的敲除细胞系中观察到高水平的 SCE1 蛋白，而在 TT1 （TT1 OE） 的过表达细胞系中观察到的水平较低（图 2C）。在 WYJ 和 TT1-OE 的 4 小时热处理期间，SCE1 蛋白的快速下降很明显，这种下降被 26S 蛋白酶体抑制剂 MG132 处理抑制（图 2D 左）。相反，在热处理后，在 tt1 ko 中未观察到 SCE1 蛋白的显着减少（图 2D 右）。在无细胞系统中孵育从大肠杆菌中纯化 His 标记的 SCE1 蛋白，显示与 tt1-ko 相比，WYJ 中 SCE1 的降解率更高，并且 MG132 显着减弱了 SCE1 降解（图 2E）。因此，这些发现表明SCE1 蛋白的不稳定性与泛素化修饰有关，并且TT1 在通过 26S 蛋白酶体促进其降解中起着至关重要的作用。为了研究其他 26S 蛋白酶体亚基是否调节 SCE1，选择了 20S 蛋白酶体的另外两个 α 亚基 PAA2 （LOC_Os07g42260） 和 PAG1 （LOC_Os01g59600） 进行实验验证。SFLC 测定显示 SCE1 不与 PAA2 或 PAG1 相互作用，表明 SCE1 可能与 TT1 特异性相互作用。此外，为了探索 26S 蛋白酶体的其他亚基是否影响 SCE1 稳定性，生成了 paa2-ko 转基因敲除系。与野生型幼苗 （ZH11） 相比，在 paa2-ko 幼苗中，观察到 SCE1 蛋白随着时间的推移下降缓慢，导致热处理后 SCE1 蛋白的蛋白水平升高（补充图 6C）。这些结果表明，PAA2 和 TT1 一样，影响 26S 蛋白酶体的功能，从而影响 SCE1 的稳定性。

为了进一步证实 SCE1 和 TT1 在生物学功能方面的遗传相互作用，研究人员使用 CRISPR/Cas9 技术生成了 SCE1 和 TT1 系的双敲除系 （sce1/tt1-ko），以及 SCE1 和 TT1 的双过表达系 （SCE1/TT1-OE） 通过在 WYJ 背景中交叉 SCE1 和 TT1 的单个过表达系（补充图 7A 和 B）。结果显示，与 WYJ 植物相比，tt1-ko 品系对热应激的敏感性更高，而 TT1-OE 品系表现出增强的耐热表型（图 2F、2H）。在热处理下，与 WYJ 植物相比，sce1/tt1-ko 植物表现出更强的耐热性，类似于 sce1-ko 植物。然而，SCE1/TT1-OE 植物表现出耐热性降低，类似于 SCE1-OE 植物（图 1F、图 2G、2I）。这些发现强烈表明，SCE1 在与 TT1 共享的遗传通路中响应热应激而发挥作用，并且可能作用于 TT1 的下游。

3、SCE1 编码一种 SUMO E2 偶联酶，可调节热处理后 SUMOylation 水平

SCE1 是一种 SUMO E2 偶联酶。为了研究 SCE1 在 SUMOylation 通路中的作用，研究人员进行了 Y2H 测定，以筛选 SCE1 在 SUMOylation 的其他组分中的潜在相互作用伴侣。SCE1 与 SUMO1 和 E3 连接酶 SIZ1 、 SIZ2 、 MMS21 相互作用 （图 3A）。同样，SFLC 测定显示 SCE1 和 SIZ1 或 MMS21 之间存在很强的相互作用，而 SCE1 和 SIZ2 之间未检测到阳性信号。采用免疫检测进行进一步分析SCE1 对 SUMO 偶联物的影响，利用与 SUMO1 蛋白具有高度保守性的拟南芥 AtSUMO1 抗体，与 WYJ 相比，在 SCE1-OE 中检测到更高水平的 SUMO 偶联物，而 sce1-ko 表现出降低的水平（图 3B）。仔细调节处理时间，以研究热胁迫下水稻中 SUMO 偶联物的诱导模型。在热处理过程中，从 5 分钟到 20 小时，SUMO 偶联物的水平在 5 分钟时迅速增加，在 15 分钟时达到峰值，30 分钟后急剧下降，最终在 2 小时后稳定在正常水平（图 3C）。值得注意的是，高水平的 SUMO 偶联物在 sce1-ko 中下降得更快，在 SCE1-OE 中下降得更慢（图 3D），而 tt1-ko 显示出类似于 SCE1-OE 的动态模式，在热应激处理的 1 小时至 4 小时内观察到更高水平的此类偶联物（图 3E）。因此，结合先前在这些材料中观察到的耐热表型，提出高水平的 SUMO 偶联物不一定赋予耐热性，保持较低的 SUMO 偶联物水平似乎可以提高高温下的热应激耐受性。

4、SCE1 响应热应激调节蛋白质折叠和复性过程

为了更深入地研究 SCE1 的分子机制，研究人员进行了 RNA 测序 （RNA-seq） 分析，以比较暴露于正常条件和热处理的 sce1ko 和 WYJ 幼苗之间的转录组学谱。总计 10,093 个基因通过该分析被鉴定为显著差异表达。发现许多基因的表达模式响应于热处理而改变。具体来说，在正常条件下，仅检测到 498 个 DEGs （差异表达基因）。然而，在热处理下，与 WYJ 相比，sce1-ko 中有 887 个 DEGs 上调，656 个 DEGs 下调（图 4A）。基因集富集分析 （GSEA） 显示，在热处理下 WYJ 和 sce1-ko 之间的 DEGs 表现出与翻译、错误折叠或不完全合成的蛋白质分解代谢过程、蛋白质折叠、蛋白质重折叠和未折叠蛋白质结合相关的注释生物学功能的富集，所有这些都已知可抵御各种环境压力（图 4B-D）。

从四个子簇获得的基因用于构建热图，显示正常条件下 WYJ 和 sce1-ko 之间的转录没有显着差异（图 4E）。与热应激后 WYJ 相比，第一组在 WYJ 中的表达水平较低，但在 sce1-ko 中的表达水平较高。第二组显示热应激前后 WYJ 的转录表达相似。然而，在 sce1-ko 植物中暴露于热应激后，转录活性增强。在 sce1-ko 植物中观察到的转录活性升高意味着它们可能表现出更好的消除未折叠或错误折叠蛋白质的能力，这归因于卓越的转录性能（图 4E 和补充表 5）。

从蛋白质折叠和复性途径中筛选出 3 个代表性基因，即 Cpn60β1 、 CYP20-2 和 Hsp78.4。

Hsp78 属于线粒体伴侣的 Hsp100/ClpB 家族，在重折叠和降解过程中与 Hsp70 系统合作。与正常条件相比，研究人员发现这三个基因的表达在热处理后上调，通过 qRT-PCR 在 WYJ 和 sce1-ko 中测定（图 4F-H）。在 sce1-ko 的热处理条件下，这三个基因的表达水平明显更高，与 WYJ 相比，倍数变化为 2.05、3.56 和 1.72（图 4F-H）。这些发现进一步支持 SCE1 参与蛋白质折叠相关通路，特别是响应热处理。

研究人员使用 IP-MS/MS 法在体内筛选了 SCE1 的相互作用蛋白。该结果揭示了 1,000 多种潜在的 SCE1 相互作用蛋白，富含核糖体、碳代谢、蛋白酶体、氧化磷酸化、吞噬体和内质网中的蛋白质加工等途径（图 4I）。内质网中富含蛋白质加工的途径包括几种小的热休克蛋白 （sHSP）。由于HSP 可以作为分子伴侣来促进受损蛋白质的重折叠过程，两个 sHSP，Hsp24.1 和 Hsp40 是潜在的 SCE1 靶标。SFLC 测定进一步揭示了 Hsp24.1、Hsp40 和 SCE1 之间的显着相互作用（图 4J 和 K）。总的来说，这些结果表明 SCE1 可能在转录和蛋白质水平直接或间接影响各种生物过程，包括蛋白质折叠相关途径。

5、小热休克蛋白 Hsp24.1 参与 SCE1 调节的耐热途径

鉴于 SCE1 负向调节耐热性，而 sHSPs 充当分子伴侣，可能正向调节耐热性，研究人员进一步研究了 SCE1 和 sHSP 之间的关系。首先生成并评估了 Hsp24.1 和 Hsp40 敲除线的耐热性。与 ZH11 或 WYJ 相比，hsp24.1-ko 和 hsp40-ko 对热应激更敏感（图 5A 和补充图 10A-C）。这些发现表明，Hsp24.1 和 Hsp40 可能有助于水稻的耐热性，这可能取决于它们的蛋白质水平。Hsp24.1 编码一种特定的线粒体蛋白具有 N 末端线粒体信号肽（1-38 个氨基酸）（补充图 11A）。为了验证 Hsp24.1 的亚细胞定位，研究人员将 Hsp24.1-YFP 融合构建体瞬时转染到水稻原生质体中。Hsp24.1 YFP 融合蛋白部分与 Mito 跟踪器（线粒体标志物）共定位（补充图 11B）。这可能是因为全长 Hsp24.1-YFP 融合蛋白尚未进入线粒体，保留了它们的 N 端信号肽。

接下来，为了研究 SCE1 和 Hsp24.1 之间的相互作用位点，研究人员在水稻原生质体中进行了 BiFC 测定。结果显示 cCFP-SCE1 和 nVenus-Hsp24.1 之间存在很强的相互作用，相互作用信号不与 Mito 跟踪器共定位，表明 SCE1 与细胞质中的 Hsp24.1 相互作用，可能与其前体（全长蛋白）相互作用。先前的研究表明，SUMOylation 可以增强底物蛋白的稳定性，或促进其降解。因此，假设 SCE1 可能通过 SUMO 化调节 Hsp24.1 的蛋白质稳定性。

为了检验这一假设，研究人员进一步分析了 WYJ 和 sce1-ko 幼苗中的 Hsp24.1 蛋白水平。在热应激下，与 WYJ 幼苗相比，6 小时及更长时间后 sce1-ko 幼苗中的 Hsp24.1 蛋白水平显着升高（图 5B）。与此一致，SCE1-OE 幼苗中的 Hsp24.1 蛋白水平显著降低（图 5C）。由于 TT1 可能在负向调节 SCE1 蛋白水平中发挥关键作用，因此进一步检测了 tt1-ko 幼苗中 Hsp24.1 蛋白水平。与 WYJ 相比，在热应激下观察到 tt1-ko 幼苗的 Hsp24.1 蛋白水平显着降低（图 5D 和补充图 12A），这可能是由于 tt1-ko 幼苗中的 SCE1 蛋白水平增加。

为了排除这些效应是由转录调控引起的可能性，研究人员测量了 Hsp24.1 转录水平。尽管 Hsp24.1 转录在热应激下上调，但 WYJ 和 sce1-ko 幼苗之间没有显着差异（，表明 Hsp24.1 蛋白水平的差异不是由于转录调控。这些结果表明，SCE1 负向调节 Hsp24.1 蛋白水平，并且 Hsp24.1 在热应激中起关键作用。

Hsp24.1 的积累可能受其 SUMOylation 的影响。为了确定 Hsp24.1 和 Hsp40 是否是 SUMO 底物，进行了体外 SUMO化测定。Hsp24.1 和 Hsp40 被鉴定为 SUMO 底物，在体外 SUMO化系统存在 OsSUMO1、AtSAE1 和 OsSCE1 时观察到其分子量的变化（图 5E）。同时，Hsp24.1 和 Hsp40 在 Y2H 测定中均表现出与 OsSUMO1 的相互作用。使用 GPS-SUMO 2.0 预测 Hsp24.1 的潜在 SUMO 化位点，该 GPS-SUMO 2.0 鉴定了四个候选赖氨酸 （K） 残基：K157、K192、K206 和 K208。随后，将这四个赖氨酸残基突变为 Hsp24.1 中的精氨酸残基，产生一种名为 Hsp24.1M 的突变形式，并进行了体外 SUMOylation 测定。在 AtSUMO1、AtSAE1 和 AtSCE1 存在下，Hsp24.1 被 SUMO 化，但在 Hsp24.1M 中未检测到 SUMO 修饰的条带，支持这四个赖氨酸残基是 Hsp24.1 的候选 SUMO 偶联位点的观点（图 5F）。为了进一步研究 SUMOylation 是否影响 Hsp24.1 蛋白的稳定性，使用纯化的Hsp24.1 及其突变形式 Hsp24.1M。结果表明，与 sce1-ko 裂解物相比，Hsp24.1 在 WYJ 裂解物中的降解速度更快，而 Hsp24.1M 在 WYJ 和 sce1-ko 裂解物中表现出相似的降解速率（图 5G-H）。这些发现表明，Hsp24.1 的 SUMOylation 会影响其蛋白质稳定性，而 SCE1 的缺失会阻止 Hsp24.1 的降解。

Hsp24.1 已被证明具有分子伴侣的作用，可防止蛋白质聚集并增强耐热性。研究人员使用限制性内切酶 NdeI 作为底物证实了 Hsp24.1 和 Hsp24.1M 的伴侣活性。将纯化的 Hsp24.1/Hsp24.1M 蛋白与 NdeI 在不同温度 （37–50 °C） 下孵育 90 分钟，将不含 Hsp24.1 的反应混合物用作阴性对照。Hsp24.1 有效保护 NdeI 即使在高达 50 °C 的温度下也能免受热诱导变性。与 Hsp24.1 相比，Hsp24.1M 在 40–50 °C 时仅对 NdeI 活性提供部分保护。这表明 Hsp24.1 中的 SUMO 化位点对其chaperone 函数。

6、敲除 SCE1 可增强耐热性并保护抽穗期的谷物产量

为了研究 SCE1 在水稻生殖阶段高温胁迫下的耐热性并评估其在稻田生产中的重要性，研究人员在位于上海松江区田地的塑料温室中对接近抽穗期的水稻植株进行了受控高温处理。塑料温室有效地模拟了热应激条件。松江市气象局获得的温度数据表明，证实不存在自然高温应力。在常温条件下，与 WYJ 相比，sce1-ko 的多个农艺性状没有观察到显着差异，包括结实率、1000 粒重和单株产量。然而，在塑料温室热处理后，sce1-ko 的穗形态与 WYJ 相似，但 sce1-ko 表现出较少的空粒数和更多的填充粒（图 6A）。此外，sce1-ko 植株显示出增强的花粉生育能力，导致结实率增加 22.9%（图 6B）。此外，sce1-ko 在高应力下表现出更大的稻粒填充能力，与 WYJ 相比，1000 粒重增加了 10.1%（图 6C）。研究人员观察到与 WYJ 相比，sce1-ko 的单株产量显着提高了 15.1%，这表明 sce1-ko 在抽穗期高温胁迫下具有更高的耐热能力（图 6D）。此外，在高温胁迫下，与 WYJ 相比，sce1-ko 的地块产量增加了 7.4%，进一步验证了其在作物生产应用中的实用价值（图 6E）。综上所述，这些结果表明，敲除 SCE1 赋予耐热性，并显著减少热胁迫引起的谷物产量损失，为培育高度耐热作物提供了新的策略。

THREE