Cell| 蓝光受体CRY2在黑暗中可以抑制根系生长

科技   2024-11-22 22:35   北京  

20241115日,深圳大学刘宏涛实验室在Cell上发表了题为The Arabidopsis blue-light photoreceptor CRY2 is active in darkness to inhibit root growth的研究内容。该研究CRY2在黑暗条件下对根长的调节功能,说明了光受体蛋白在非光激发态下也可以发挥一定的功能。


研究背景


隐花色素(CRY)是植物中普遍存在的蓝光受体,广泛参与植物的生长和发育过程中,包括光周期调控、形态建成、以及对光和其它环境信号的响应。CRY在黑暗条件中作为单体存在,在蓝光下寡聚化与各信号转导蛋白相互作用以发挥功能。然而,CRY在黑暗条件下是否具有功能,是否存在蓝光抑制的CRY互作方式目前都尚不清楚。本研通过探讨CRY2在黑暗条件下对根尖分生组织细胞分裂的调控,探索其新的非典型功能,重点研究CRY2在非蓝光条件下对植物生长的影响,从而丰富对CRY2在不同光环境下功能的认识。

研究结果


1 黑暗条件下CRY2对基因表达也有影响

之前的研究表明CRY2在红光或黑暗条件下也会影响基因的表达。作者测定了暗培养的5日龄野生型(WT)和cry2突变体的转录组并对其进行差异表达分析(图1A)及GO富集分析(图1B)以及部分定量验证(图1D-F),发现CRY2在黑暗中参与多种生物过程。后续作者又将暗培养的5日龄幼苗转移到蓝光下30 min后的转录组数据与其相比,发现CRY2在黑暗中比蓝光中有更强的差异表达效应更强(图S1)。


1 即使在黑暗中,CRY2 也对基因表达有影响


S1


2 CRY2 主要通过调节细胞分裂在黑暗中调节根系发育

由于CRY2在黑暗中对基因转录存在明显的影响,作者认为黑暗条件下也可能会存在明显的表型。作者在黑暗和蓝光下进行了cry2WT的表型分析。在无蓝光条件下,CRY2抑制根的延长生长,并且蓝光可以减弱这一抑制作用(图 2A-D)。在cry2过表达中回补CRY2出现类似的表型(图S2C-E)。cry2突变体在根尖分生区有更多细胞分裂活动,尤其在暗环境下表现更为明显(图2E-2I);同时CRY2在暗环境中抑制与DNA复制和细胞分裂相关基因的表达(图2K),这种抑制作用在蓝光条件下被减弱(图S2P),表明CRY2主要在黑暗环境中通过抑制细胞分裂相关基因的转录来调控根系发育。


2 CRY2 主要通过调节细胞分裂在黑暗中调节根系发育


S2


3 CRY2FL1FL3发生互作,这些互作受到蓝光的抑制

作者认为还存在其它蛋白通过蓝光抑制的方式与CRY2互作来调节根系生长,因此作者进行了酵母双杂筛库、免疫共沉淀以及质谱来鉴定黑暗条件下CRY2的互作蛋白,最终确定了两个候选成员FL1FL3(图S3 A)。进一步对这两个成员进行验证发现,FL1FL3以白光(仅蓝光部分)抑制的方式与CRY2互作,而不与CRY1互作(图S3 B-E)。光激发突变体CRY2W374A也不能与 FL1FL3互作(图S3 F-S3 G)。Co-IP结果表型与以上结果一致(图S3 J-F和图3 D-F),这进一步说明了CRY2 以蓝光抑制方式与FL1FL3互作。

为解释蓝光如何诱导CRY2抑制这种互作,作者使用一些片段对其互作结构域进行了鉴定(图S4A)。结果证明FL1FL3N端是以及CRY2PHR结构域是它们互作的关键部位,但不受光照影响(图3G和图S4B)。因此作者认为可能是C端的空间位置阻拦了这种互作。


S3


3 CRY2FL1FL3发生物理相互作用,这些相互作用受到蓝光的抑制


S4 CRY2FL1/FL3通过其N末端进行物理交互


4 FLs主要通过调节细胞分裂在蓝光下调节根发育

属于拟南芥中的FL家族(图S5A-B),可能在根的伸长方面具有潜在作用(图4A)。作者构建了FL1FL3单突变体fl1sdfl3sd和双突变体fl1sd fl3sd,发现FL1FL3属于功能冗余蛋白,仅双突变体fl1sdfl3sd表和四突变体flΔ4表现出显著根系发育缺陷,且这种表型在蓝光条件下更为显著(图S5G-H)。对flΔ4回补FL1FL3,拯救了其根缺陷的表型(图S5K-L)。5 dflΔ4幼苗在黑暗和蓝光下的根都短于WT(图4A-C),表明FL促进蓝光诱导的根伸长。

前文已经验证过CRY2通过抑制根尖细胞分裂从而影响根的伸长,作者又进一步验证了FL是否也是通过同样的途径影响根的表型。作者检测了WTflΔ4FL1/FL3-GFPflΔ4根中的细胞分裂情况,与野生型相比,flΔ4突变体在蓝光下细胞分裂活性较低(图4E-4J),过表达可以恢复这种表型(图 S5N S5O)。

蓝光下生长素合成突变体yucQ根的伸长收到抑制,但对flΔ4施加生长素类似物不能挽救这种抑制,表明生长素可能不参与CRY2-FL依赖性根伸长机制(图S5S-T)。


S5 拟南芥突变体表型


4 FORKED-LIKE蛋白主要通过调节细胞分裂在蓝光下调节根发育


5 FLs促进细胞分裂基因的转录

为鉴定FL在根伸长中调节的下游基因,作者对暗培养的5日龄WTflΔ4幼苗进行转录组测序。差异表达分析和GO富集分析结果表明FLCRY2均在细胞分裂的DNA复制过程中发挥作用(图5A-B和图1A)。与抑制细胞分裂基因表达的作用相对,FLs促进CRY2抑制的细胞分裂过程等(图S6B-C,图5D),与表型一致(图2和图4)。


5 FLs促进细胞分裂基因的转录


S6

6 在黑暗条件下CRY2通过抑制FL调节细胞分裂

实验发现,与cry2突变体相比,cry2 flΔ4五元突变体的根长与细胞分裂水平有所下降(图6A-F,图S7DS7E),同时cry2 中上调的细胞分裂相关基因在cry2 flΔ4中相对降低(图S7C),这表明FLs可能在CRY2的下游发挥作用。

作者又在WTcry2中过表达了FL1FL3,通过比较蓝光与黑暗条件下根长的比值,发现FL1/FL3-FLAG的蓝光诱导效应在cry2突变背景中减弱(图S7G),但FL1FL3的蛋白丰度在蓝光和暗环境以及在WTcry2背景中的差异均不显著(图 S7N-O),同时FL1/FL3-FLAG背景中细胞分裂活动比FL1/FL3-FLAGcry2更强(图S7H-M),说明CRY2FL1FL3的活性调控有重要作用,但这种作用并不是通过改变FL1FL3的蛋白丰度来发挥的,可能是通过互作结合而发挥抑制作用。


S7


6 在黑暗条件下CRY2通过抑制FL调节细胞分裂

7 CRY2抑制FL1FL3与细胞分裂基因周围染色质的结合

作者认为FLs可能也在转录调控中发挥作用,因此对蓝光下生长的WTFL3-FLAG幼苗进行染色质免疫沉淀测序,发现FLE2F基序(S期细胞分裂基因的转录因子家族特征)相关。ChIP-qPCR结果显示,FL1/FL3-FLAG中细胞分裂相关基因的富集程度相比WT显著升高(图7A-B),并且在根中对细胞分裂相关基因的染色质结合更显著(图S7-R             

黑暗条件下的FL1/FL3-FLAGcry2突变体与FL1/FL3-FLAG相比,FLs对细胞分裂基因的染色质结合显著增强(图7C-D),而蓝光下FL1/FL3-FLAG对染色质的结合比黑暗条件下更强(图7E-F),这说明CRY2在黑暗条件下可能会抑制FLs的染色质结合功能,而蓝光通过诱导CRY2FLs的解离,缓解了CRY2FLs的抑制作用,使FLs 的功能得以释放。


7 CRY2抑制FL1FL3与细胞分裂基因周围染色质的结合

评述

本研究揭示了CRY2在黑暗条件下的非典型功能,发现它通过抑制FL1和 FL3与染色质的结合来降低细胞分裂基因的表达,抑制根系发育。蓝光条件下,CRY2与FLs的结合被解除,FLs能够激活细胞分裂基因,促进根系延长生长。这一机制表明,CRY2 在暗环境中和蓝光下的功能具有动态可塑性,通过调控 FLs 的活性和与染色质的结合,协调植物在不同光照条件下(不同部位)生长发育的需求。

END



评述:王冬月

编辑:何宇飞

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