温故知新| 甘蔗AMT2;1在铵从根到芽的转运中发挥作用

氮是植物组织中含量最多的矿物质元素，硝酸盐（NO₃^-）和铵（NH₄⁺）是高等植物根系吸收的主要无机元素。NH₄⁺由铵转运体/甲基铵过氧化物酶/恒河猴（AMT/MEP/Rh）家族的蛋白质跨细胞膜转运，存在于所有生物体中。植物AMT可进一步分为AMT1和AMT2。AMT1蛋白在其他植物物种，包括农作物中的功能和调节特性已经证实了它们在根部高亲和性NH₄⁺吸收中的主导作用。与AMT1型蛋白质相比，关于AMT2蛋白质的生理功能的信息较少。

细菌人工染色体（BAC）克隆中ScAMT2;1的鉴定和功能表征序列的选择

研究人员鉴定了5个含有与ScAMT2;1转录本密切相关的序列的克隆（即BAC032_A12、BAC038_G02、BAC118_C18、BAC216_D16和BAC235_F05），由于甘蔗栽培品种是S.officinarum和S.spontaneum种间杂交产生的多倍体，已鉴定的含有不同ScAMT2;1基因座的BAC克隆的周围拓扑结构预计会有所不同（图1）。来自BAC克隆comp105883和一个S.spontaneumAMT2;1的AMT2;1序列的推导氨基酸比对表明，BAC118_C18具有与转录组装序列（comp105883）相同的蛋白质序列。

图1.甘蔗BAC克隆和S.bicolor中含有AMT2;1的基因组序列（100Kb）的物理图谱

ScAMT2;1表达受无机氮源和无机氮水平的调控

在氮充足条件下的生长发育阶段（株龄90d），ScAMT2;1在所有分析器官中均有表达，其中根部的转录本积累最多，但成熟叶片中也有大量表达，其次是幼叶，芽中的表达量较少（图2A）。为了评估ScAMT2;1的表达如何受到氮供应的调控，测定了在含有不同氮源或不含氮源的营养液中生长14天的植物各器官中的转录物水平（图2B）。与在硝酸铵（+N）中生长的植物相比，在硝酸盐（NO₃^-）作为唯一氮源的情况下，ScAMT2;1转录物在根、成熟叶片和芽中的积累量大约增加了2到3倍，在幼叶中则变化不显著。

图2.在不同无机氮源或无氮源条件下，甘蔗器官中ScAMT2;1的表达情况

ScAMT2;1在缺陷突变酵母中略微促进铵的吸收

为了研究筛选出的ScAMT2;1基因（BAC118_C18）是否编码功能性铵转运体，研究人员利用酿酒酵母三重mep突变体（31019b）进行了互补。阳性对照（AtAMT1;1）在所有测试的氮条件下都能完全恢复生长（图3）。通过增加外部NH₄⁺浓度，与阴性对照相比，用ScAMT2;1进行互补的三重mep细胞的生长略有增加，表明ScAMT2;1是介导铵转运的功能蛋白。在5mM铵浓度下，pH值为5.0和6.0时，表达ScAMT2;1的三重mep的生长略好于阴性对照（空pDR196）。将pH值进一步提高到7.5可能会增加铵（NH3）的浓度，从而导致表达ScAMT2;1的三重mep与阴性对照的生长情况相似。

与AMT1蛋白不同的是，AMT2被认为不能渗透毒性铵（MeA）的运输。在补充了100mMMeA的培养基上，MeA的毒性作用大大降低了表达AtAMT1;1的三重mep细胞的生长，而ScAMT2;1或空载体的细胞对MeA没有明显的敏感性。（图3）。

图3.铵吸收缺陷酵母突变体的功能互补

ScAMT2;1可回补拟南芥四重突变体的铵吸收缺陷

ScAMT2;1由CaMV35S启动子(p35S)驱动，在拟南芥四重AMT突变系(qko)中表达。qko+p35S::ScAMT2;1纯合系在铵作为唯一氮源的条件下生长，积累的总干生物量明显高于qko，在2mM NH₄⁺条件下，其值分别高出约65%（#1）和51%（#2）（图4A、B）。相反，当提供0.5mM NO₃^-时，qko和过表达品系之间没有观察到明显差异（图4A、B），这表明ScAMT2;1的异位表达只在铵营养条件下恢复了qko突变体的生长表型，这可能是通过介导根对铵的吸收实现的。

然后，研究人员评估了qkoScAMT2;1互补株系中¹⁵N-NH₄⁺的短期流入量。在-N条件下，qko+p35S::ScAMT2;1的根铵吸收能力比qko提高了87%（图4C）。为了估算ScAMT2;1的底物亲和性，将六周龄的ScAMT2;1过表达（p35S）qko植物在-N条件下生长3d，然后进行浓度依赖性¹⁵N-NH₄⁺流入分析。ScAMT2;1的功能在90µM以上达到饱和（图4D）。估计的铵净流入量与Michaelis-Menten方程十分吻合，得出Km=90.17µM，V_max为338.99µM h^-1g^-1root DW（通过减去qko值确定）（图4D）。

图4.对拟南芥qko突变体进行功能评估

ScAMT2;1调控区驱动拟南芥根和芽维管组织中的表达，并受氮源和可用性的调控

为了确定ScAMT2;1的功能，研究人员表达了由BAC118_C18（p1ScAMT2;1）和BAC235_F05（p2ScAMT2;1）的ScAMT2;1调控区驱动的GUS报告基因。表达p2ScAMT2;1::GUS的拟南芥品系可以追踪铵或硝酸铵条件下叶片维管束和最外层细胞中启动子的活性（图5A）。相反，缺氮植株的叶片外层细胞中没有p2ScAMT2;1活性，并且活性似乎主要在维管束中（图5A）。在根中，GUS主要在最内层组织中检测到（图5B）。

图5.在不同氮或缺氮条件下1、3、5和10d的Col-0拟南芥植株中内源ScAMT2;1启动子（p2）驱动GUS表达

甘蔗ScAMT2;1启动子根据外部氮水平和来源调节铵吸收

生成由内源调控区p2ScAMT2;1驱动的ScAMT2;1互补qko株系，来评估ScAMT2;1对铵吸收的贡献。虽然所有p2ScAMT2;1::ScAMT2;1互补株系和qko在添加了2mM硝酸盐或0.2mM铵盐的琼脂培养基上生长相似（图6A），但qko+p2ScAMT2;1::ScAMT2;1植物的总生物量在较高的外部NH₄⁺浓度下明显优于qko。在2mM NH₄⁺浓度下，qko+p2ScAMT2;1::ScAMT2;1积累的生物量比qko多出约83%（＃1）、103%（＃2）或28%（＃3）（图6A）。在4mM NH₄⁺条件下生长的植株的生物量积累比qko高102%（#1）、75%（#2）或107%（#3）（图6A）。

在2mM的铵、硝酸盐或无氮（-N）条件下，对qko+p2ScAMT2;1::ScAMT2;1植物进行了短期¹⁵N铵流入量分析。-N条件下，¹⁵N-NH₄⁺流入的qko株系和互补株系根部的情况相似且不显著（图6B）。与qko相比，在2mM硝酸盐条件下，用ScAMT2;1进行互补可显著提高吸收水平6%（＃1）和43%（＃2）；在2mM铵条件下，用ScAMT2;1进行互补可显著提高吸收水平61%（＃1）和78%（＃2）（图6B）。

图6.拟南芥突变体植株和由甘蔗内源启动子驱动的ScAMT2;1互补株系的生物量积累

ScAMT2;1调控区似乎驱动铵从根向芽的转移

此外，研究人员进一步评估了ScAMT2;1是否在铵供应条件下介导根到芽的铵转运。将qko和qko+p2ScAMT2;1::ScAMT2;1株系在0.2mM或4mM¹⁵N-NH₄⁺中处理1小时，以便有时间进行根到芽的转运，来评估ScAMT2；1的特异性功能（图7A）。与qko相比，在供应0.2mM ¹⁵N-NH₄⁺时，芽中没有明显的¹⁵N积累，而在一个转基因品系（#2）中，根中出现了一些¹⁵N积累。当植物在4mM ¹⁵N-NH₄⁺下生长时，qko和互补系的根积累¹⁵N的模式相似。相比之下，qko+p2ScAMT2;1::ScAMT2;1两个品系的芽中积累的¹⁵N明显较多，分别比qko芽中多出约35%和25%（图7A）。与整个植株相比，qko+p2ScAMT2;1::ScAMT2;1品系在芽中积累的¹⁵N比率分别为7%和6.3%，明显高于对植株施加4mM¹⁵N-NH₄⁺时在qko中观察到的4.8%（图7B）。

图7.在甘蔗内源启动子 (p2) 的调控下，表达ScAMT2;1的qko和互补qko转基因品系的根和芽中的¹⁵N积累

原文链接：https://doi.org/10.3389/fpls.2022.1039041

评述：张惠

编辑：赵一梅